Способ выявления нестабильного гемоглобина в крови

 

Изобретение относится к экспериментальной медицине, гематологии, а именно к способам выявления нестабильного гемоглобина в крови. Целью изобретения является упрощение способа. Берут кровь из пальца в количестве 0,1-0,2 мл капилляром, предварительно смоченным гепарином, отстаивают, плазму удаляют. Гемолизат не готовят, а для анализа используют эритроциты, которые в количестве 0,01-0,02 мл добавляют к 2,5-3 мл приготовленной за 30 мин до анализа и тщательно перемешанной смеси 6,5-5,5% н-бутанола в 0,1 М натрий-фосфатном буфере, содержащем 10<SP POS="POST">-3</SP>М NA<SB POS="POST">2</SB> этилен диамино-тетрацксусной кислоты с PH 7,4 при 18-25°С. Суспензию эритроцитов в смеси осторожно перемешивают. Через 3±1 мин эритроциты донора и пациента растворяются в этой смеси, и суспензия становится прозрачной. Оба раствора - контрольный и исследуемый-инкубируют при температуре 18-25°С. Через 5-60 мин раствор эритроцитов носителя нестабильного Нв мутнеет, а контроль остается прозрачным. Помутнение раствора регистрируют визуально или путем измерения оптической плотности при 700±5 нм. Установлена обратная зависимость между температурой и объемной концентрацией н-бутанола в фосфатном буфере.

СОЮЗ СОВЕТСНИ

СО1.!ИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (191 (И) (50 4 С 01 11 33/72

pg pilii) .«5, Ч21,1йЯ

Е . Б „19 . - 41

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И OTHPbWHRM

ПРИ ГКНТ СССР

1. (21) 4253420/28-14 (22) 29.05.87 (46) 15.09.89. Бюл. ¹ 34 (71) Центральный научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови (72) Т.П. Молчанова (53) 612.015(088.8) (56) Carrell R.W. and Kay R. Simple

Method for the detection of unstable

haemoglobin. — But. Y. Haematology, 1972, v. 25, р. 615-629. (54) СПОСОБ ВЬИВЛЕНИЯ НЕСТАБИЛЬНОГО

ГЕМОГЛОБИНА В КРОВИ (57) Изобретение относится к экспериментальной медицине, гематологии, а именно к способам выявления нестабильного гемоглобина в крови. Целью изобретения является упрощение способа, Берут кровь из пальца в количестве

0,1-0,2 мл капилляром, предварительно смоченным гепарином, отстаивают, плазИзобретение относится к экспериментальной медицине, к гематологии, а именно к диагностике. гемоглобинопатнй, обусловленных носительством мутантных нестабильных гемоглобинов (Нв) .

Цель изобретения — упрощение способа.

Цель достигается тем, что непосредственно эритроциты крови донора и па-ь циента, взятой из пальца, суспензируют в специально приготовленной смеси нормального бутилового спирта — H-5утанола с фосфатным буфером при 182 му удаляют. Гемолиэат не готовят, а для анализа используют эритроциты, которые в количестве 0,01-0,02 мл добавляют к 2,5-3 мл приготовленной за

30 мин до анализа и тщательно перемешанной смеси 6,5-5,5Х н-бутанола в

0,1 M натрий-фосфатном буфере, содержащем 10 М Ма ЭДТА с рН 7,4 при 18-25 С.

Суспензию эритроцитов в смеси осторожно перемешивают. Через 3+ 1 мин эритроциты донора и пациента растворяются в этой смеси, и суспензия становится прозрачной, Оба раствора — контрольный и исследуемый — инкубируют при

I8-25 С. Через 5-60 мин раствор эритроцитов носителя нестабильного Нв мутнеет, а контроль остается проэрач- 3 ным, Помутнение раствора регистрируют визуально или путем измерения оптической плотности при 700+5 нм. Установлена обратная зависимость между температурой и объемной концентрацией н-бутанола в фосфатном.буфере.

250 С с получением прозрачного раствора. Наличие в крови нестабильного Нв регистрируют по помутнению раствора через 5-60 мин по сравнению с прозрачным контролем.

Способ осуществляется следующим образом.

Для,исследования кровь берут из пальца в количестве 0,1-0,2 мл капилляром, предварительно смоченным гепарином. Затем кровь отстаивают в течение 30-60 мин, плазму удаляют.

Для анализа используют эритроциты.

Эритроциты в количестве 0,01-0,02 мл

3 150816 добавляют к 2,5-3 мл приготовленной за 30 мин до анализа и тщательно перемешанной смеси 6,5-5,5% н-бутанола в О,l M натрий-фосфатном буфере, со— 3 5 держащем 10 И натриевой соли этилендиаминотетрауксусной кислоты (Na<

ЭДТА7 с рН 7,4 при 18-25 С. Суспензию эритроцитов в смеси осторожно перемешивают палочкой или покачивая пробирку рукой. Через 3-1 мин эритроциты донора и пациента растворяются в этой смеси и суспензия становится прозрачной, Оба раствора — контрольный о и исследуемый инкубируют при 18-25 С

30 мин. Через 5-60 мин раствор эритроцитов носителя нестабильного Нв мутнеет, а контроль остается прозрачным. Помутнение раствора регистрируют визуально или путем измерения 20 рассеяния растворов без предварительного центрифугирования при 700-5 нм на спектрофотометре.

Установлена обратная зависимость 25 между температурой и объемной концентрацией н-бутанола в фосфатном буфере. Для различных интервалов температур составлена таблица, которой следует руководствоваться при выборе 30 условий выявления нестабильного Нв в крови предложенным способом.

Пример 1. Больная Б (Московская городская детская клиническая больница Р 1, история болезни Р 9143) страдает врожденной гемолитической анемией и цианозом. Из пальца берут

0,1 мл крови гематокритным капилляром. Отстаивают, через 30 мин плазму удаляют капилляром. 0,01 мл эритроци- 40 о тов больной добавляют при 20 С к

2,5 мл за 30 мин приготовленной и тщательно перемешанной смеси 6,5% н-бутанола в 0,01 И натрий-фосфатном буфере, содержащем 10 N Na ЭДТА рН

7,4, Аналогичным образом готовят контроль. Смеси осторожно перемешивают путем покачивания пробирки рукой.

Через 4 мин суспензии эритроцитов стали прозрачными. Оба раствора инкубируют при 20 С. Через 5 мин раствор зритроцитов больной мутнеет, а конт, роль остается прозрачным, После регистрации оптических плотностей растворов на спектрофотометре "Спекорд" при 700 нм получают следующие показания: контроль 0,03 опт.ед., больная 0,7 опт.ед. У больной диагносцировано носительство нестабильного Hs, 8 4

Пример 2. Больная P (ЦНИИ гематологии и переливания крови МЗ

СССР, история болезни - 299) страдает наследственной гемолитической анемией. Из пальца берут 0 1 мл крови капилляром, предварительно смоченным гепарином. Кровь отстаивают 45 мин, плазму удаляют капилляром. 0,015 мл эритроцитов больной добавляют при

23 С к 3 мл за 30 мин приготовленной и тщательно перемешанной смеси 6,0 н-бутанола в 0,1 И натрий-фосфатном буфере, содержащем 10 N Na ЭДТА с рН 7,4. Аналогичным образом готовят контроль. Смеси осторожно перемешивают стеклянной палочкой. Через 3 мин обе суспензии эритроцитов становятся прозрачными. Пнкубируют при 23 С. Через 15 мин раствор эритроцитов значительно мутнеет, а контроль остается прозрачным. После регистрации оптических плотностей растворов при

702 нм на спектрофотометре "Спекорд" получают следующие показания: контроль 0,02 опт.ед., больная 1,4 опт. ед. У больной диагносцировано носительство нестабильного Нв.

Пример 3. Больная Ш (Московская городская детская клиническая больница Р 1, история болезни Р 17462) имеет жалобы на повышенную утомляемость, периодические головные боли.

Из пальца берут 0 15 мл крови гематокритным капилляром. Кровь отстаивают 60 мин, плазму удаляют капилляром.

0,02 мл эритроцитов больной добавляют при 25"С к 3 мл за 30 мин приготовленной и тщательно перемешанной смеси 5,5 па н-бутанола в 0,1 И натрий-фосфатном буфере, содержащем 10 М

Иа ЭДТА с рН 7,4. Аналогичным образом готовят контроль. Смеси осторожно перемешивают путем покачивания пробирки рукой. Через 3 мин суспензии эритроцитов становятся прозрачными. Оба о раствора инкубируют 60 мин при 25 С.

Раствор эритроцитов больной через

60 мин мутнеет, а контроль остается прозрачным, После регистрации оптических плотностей при 700 нм на спектрофатометре "Спекорд" получают следующие показания: контроль 0,035 опт.ед., больная — 0,93 опт.ед, У больной диагносцировано носительство нестабильного Нв, Упрощение способа выявления нестабильного Нв позволяет: проводить анания.

Составитель В. Митюшин

Техред М.Моргентал

Корректор Л. Бескид

Редактор М. Келемеш

Заказ 5536/48 Тираж 789 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина,101

5 15081 лиз на микроуровне — на крови объемом

0,1-0,2 мл, взятой из пальца; сократить стадии приготовления гемолиэата, термостатирования и прецизионных спектральных измерений, которые длительны и требуют использования специального оборудования. Введенные упрощения позволяют не только детектировать нестабильные Нв у гематоло-. гических больных, но и проводить массовые профилактические и популяционные обследования населе

68 6

:Формула изобретения

Способ выявления нестабильного гемоглобина в крови, включающий взятие крови, получение эритроцитов и последующую обработку пробы органическим растворителем с последующей регистрацией оптической плотности пробы, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, пробу эритроцитов инкубируют 30 мин при о

18-25 С в смеси, состоящей из 6,5S,5 н-бутанола в О,! М натрий"фосфатном буфере, при рН 7,4, содержащем

10 М этилендиаминтетраацетат натрия.

-э