Штамм грибов aspergillus flavipes - продуцент тирозиназы

 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а imeHно к новому штамму плесневого гриба рода Aspergillus flavipes - продуцента тирозиназы, находящей применение при трансформации L-тироэина в L-дигидрооксифенилаланин. Цель изобретения - выявление штамма грибов, продуцирующего тирозиназу с более высокой активностью. Изобретение заключается в том, что выделен новый штамм ВКПМ F-351. Культуру выращивают на питательной среде следующего состава, г/л: сахароза 5,0; 1,0; , 0,93; MgS04 0,5; KCl 0,5; FeS04-7H,jO 0,01; CuS04-5H20 0,01, П,Ь-тирозин 0,01; гидролизный лигнин 5,0; дистиллированная вода - до 1 л, активность ферментного раствора полученного супернатанта 50 МЕ/мл или в расчете на биомассу 500 ед/г сырой биомассы. i (Л

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (192 (112

А1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А BTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО.ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 4225919/28-13 (22) 10.04.87 (46) 15.11.88. Бюл. У 42 (7 1) Армянский филиал Всесоюзного научно-исследовательского института химических реактивов и особо чистых химических веществ (72) Г.С.Гукасян, 3.Н.Багдасарян и В.Г.Пасоян (53) 663.18(088.8) (56) Gutteridge S., Robb D. - Eur.

J. Biochem, 1975, 54, 107-116.

Акцептованная заявка Японии

9 52-8399, кл. С 12 D 13/06, опублик. 1977. (54) ШТАММ ГРИБОВ ASPERGILLUS PLA- .

UIPES — ПРОДУЦЕНТ ТИРОЗИНАЗЫ (57) Изобретение относится к микробиологической промышленности, а имен-. (512 4 С 12 N 9/88//(С 12 N 9/88, С 12 N 1:16) но к новому штамму плесневого гриба рода Aspergillu.s flavipes — продуцента тирозинаэы, находящей применение при трансформации L-тирозина в L-дигидрооксифенилаланин. Цель изобретения — выявление штамма грибов, продуцирующего тироэиназу с более высокой активностью. Изобретение заключается в том, что выделен новый штамм

ВКПИ F-351. Культуру выращивают на питательной среде следующего состава, г/л: сахароза 5,0; КН, Р04 1,0; ИН4ХО

0 93; NgS04 0 5; КС1 0 5; FeS04 7Н О

0,01; CuS04 5Н О 0,01, D,L-тирозин

0,01; гидролизный лигнин 5,0; дистиллированная вода — до 1 л, активность ферментного раствора полученного супернатанта 50 МЕ/мл или в расчете на биомассу 500 ед/г сырой биомассы.

1437395

Изобретение относится к микробиологической промьппленности и представляет собой новый штамм гриба, обладающий свойством продуцировать тирозиназу, фермент, применяющийся при трансформации фенольных соединений, в частности при ферментативном синтезе L-диоксифенилаланина (L-ДОФА) из L-тирозина. 10

Цель изобретения — выявление штамма грибов, продуцирующего тирозиназу с более высокой активностью.

Штамм Aspergillus flavipes ВКПИ

F-35 1 выделен из образцов почвы, ото- 15 бранных на юге УССР, и имеет следующие характеристики.

Морфологические и культуральные. признаки, Штамм быстрорастущий„ характеризуется хорошим споропошением 20 при выращивании на синтетических средах (сусло-агар, среде Чапека, картофельно-декстрозной среде, среде

Сабуро, Ролена-Тома). На сусло-агаре колонии быстрорастущие, пушистые, белые, с возрастом светло-желтого цвета. Зксудат обильньнЪ, формируется в большие капли, частично внедренные внутрь мицелиальных мас=, светлые, затем янтарного цвета, запах 30 практически отсутствует, конидиальные головки колончатые, короткие, ко" нидиеносцы варьируют 500-800 х 5,58,0ш, едва заметно окрашенные в свет-! ло-коричневый цвет, гладкие. Вздутия эллиптические, почти шаровидные, 10,5-30 р в диаметре. Наблюдается редукция конидиеносцев. Стеригмы в

2 раза в больпких головках густо покрывают везикл, в маленьких образуют- > ся только на верхушке вздутия. Линейный рост колонии составляет на сусло" агаре: 5-й день 75 мм, 10-й день

9,5 мм; ra среде Чапека: 5-й день

80 мм, 10-й день 110 мм; на мясопептонном агаре: 5-й день 7 мм, 10-й день 12 мм.

Гифы воздушного мицелия двух типов: тонкие, нитевидные, с удлиненными клетками и более широкие, густо мелкогранулированные. Покровных кле50 ток не образует.

Физиологические и биохимические признаки. Усваивает следующие источники углерода: глюкозу, галактозу, сахароэу, мальтозу, фруктоэу, арабинозу, ксилозу, крахмал, инулин, сорбит, манит и органические кислоты. Хорошо растет на нитритном, нитратном и амПример 2. С ферментного раствора

gillus flavipes BKIIN ют, как в примере 1. целью получения культуру AsperF-351 выращиваПосле 4 сут кульмиачном азоте. Из органических источников азота ассимилируют аминокислоты. Растет в широких пределах кислотности среды (рН 2,0-9,0). Штамм не токсичен, Исследование субстратной специфичности выделенной из штамма Aspergillus flavipes ВКПМ F-351 тирозиназы показало, что фермент окисляет следующий ряд фенолов: тирозин, п-креэол, фенол, пирокатехин, 3,4-диокситолуол, 3,4-диоксифенилаланин, резорцин.

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1. Посевную культуру Aspergillus flavipes BKIIM Г-351 выращивают в пробирках на скошенной среде 2% сусло-arapa содержащего пивное сусло 2"2,5 Баллинга. Среду стерилизуот при 0,8 атм в течение

20 мин. Культуру на косяках выращио вают 4-5 сут при 28 С ° Культивирование ведут на качалках (120 об/мин) в колбах Эрленмейера. Используют жидкую среду следующего состава,г/л:

Сахароза 5,0 кн,РО4 1,0

МН,МО., 0,93

МЯ 804 0,5

КС1 0,5

Fe ЯО 7Н,, О 0,01

Cu8Оq 5Н О 0,01

D l, Тирозин 0,01

Гидролизный лигнин,=.".», 0

Дистиллированная вода До1л

125 мл среды в 500-миллилитровых колбах стерилизуют при 0,8 атм в течение 20 мин. Посев в колбы со сре,с дой проводят вводом петлей кусочка мицелия с агаровой поверхности. Кульо тивируют при 28 С на качалках, После

3 сут роста биомассу собирают и хорошо промывают дистиллированной водой, Биомассу, полученную из 500 мп питательной среды, инкубируют в 2 л

0,3%-ного раствора L-тирозина в

0,1 М КС1-НС1 буфере, рН 2,0. Через кажцые 30 мин берут пробу и определяют количество образовавшегося

1-ДОФА колориметрическим методом.

После 2 ч инкубации достигается 85%ная трансформация Ь-тирозина в L-ДОФА.

Формула изобретения

Штамм грибов Aspergillus f lavipes

ВКПМ 1-351 — продуцент тирозиназы.

Составитель Г. Мелентьева

Техред М. Ходанич Корректор Э.Лончакова

Редактор Н.Киштулинец

Заказ 5855/25

Тираж 520

Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

14373 тивирования биомассу собирают и несколько раз промывают дистиллированvo11. водой. 10 r биомассы гомогенизируют в 100 мл дистиллированной воды.

Гомогенат центрифугируют при

6000 об/мин в течение 30 мин. Полученный супернатант представляет собой ферментный раствор с активностью

50 1П/мл или в расчете на биомассу

500 ед./r сырой биомассы, Активность определяют по окислению L-тирозина.

Реакционная смесь содержит: 1 мл

10 М раствора L-тирозина в дистиллированной Н О, 1 мл 0,5 M Na-фосфатного буфера, рН 6,5, 0,1 мл раствора фермента и 0,9 мл дистиллированной Н О (объем 3 мл). Реакцию про95

4 водят при 25 С, за единицу активности принимают количество фермента, который приводит к увеличению оптической плотности реакционной смеси при 280 нм на 0,001 ед./мин.

Таким образом, использование нового штамма позволяет осуществлять

Г

857-ную, трансформацию L-тирозина в

L-ДОФА за 2 ч вместо 5, как в известном способе, что свидетельствует о более высокой тирозиназной активности культуры.