Способ получения l-карнитина
Изобретение относится к бйотех ,нологии и касается получения Ь-карни тина. Цель изобретения - повьшение выхода.L-карнитина. Это достигается тем, что бактериальный ,штамм продуцента выращивают на питательной cpe-l да, содержащей в качестве источника углерода и азота 1р бутиробетаин или кротонобетаин, факторы роста в условиях аэрации до максимального накопления целевого продукта с последующим его вьщелением, в качестве бактериального пггамма продуцента используют Agrobacterium НК 4, или Agrobac- terium НК 13, или Agrobacteriura Ж 1331, при этом у-бутиробетаин или кротонобетаин вводят в количестве 0,1-10,0%.
CQOS СОВЕТСНИХ
РЕСПУБЛИН
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Н ПАТЕНТУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ OCCP
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И OTHPblTMA (21) 3874110/28-13 (22) 28.03.85 (3.1) 1600/84 (32) 29.03.84 (33) СН (46) 30.10.88. Бюл. Я 40 (71) Лонца АГ (СН) (72) Ханс Кулла (DK) и Павел Лехки (СН) (53) 663.1(088.8) (56) Hindstedt at al The Parmation
and Degradation of Caruitin in Pseudomonas. - J. Biochemistry, 1967, .
6, 12621270. (54) СПОСОВ ПОЛУЧЕНИЯ L-КАРНИТИНА (57) Изобретение относится к бйотех,нологии и касается получения L-карни„SU „„1435159 А 3 (51) 4 С 12 Р 23/00, С 12 Ы 1/20 // (С 12 Ы 1/20 С 12 R 1:01) тина. Цель изобретения — повышение . выхода. L-карнитина. Это достигается тем, что бактериальный штамм продуцента выращивают на питательной сре-. де, содержащей в качестве источника углерода и азота g-бутиробетаин или кротонобетаин, факторы роста в условиях аэрации до максимального накопления целевого продукта с последующим его выделением, в качестве бактериального штамма продуцента используют Agrobacterium НК 4, или Agrobacterium НК 13, или Agrobacterium
HK 1331 при этом т-бутиробетаин или кротонобетаин вводят в количест« ве 0,1-10,0%.
1435159
Описание штамма АягоЬасйегЫш НК 4 (РЯМ В 2938):
Образование фенилаланин деаминазы орннтйндекарбоксилаэы
Форма клеток палочки, частично плеоморфны
1-2
0,5-0,8
Длина, мкм
Ширина, мкм
Подвижность
Жгутикование перитрихальное
Использование субстрата ацетата
Изобретение относится к биотехнологии н касается получения L-карнитина.
Целью изобретения является повышение выхода L-карнитина.
Способ заключается в следующем.
Предлагаемые микроорганизмы .способны вырабатывать иэ кротонобетаина или g-бутиробетаина Е-каринтии, не 1п разлагая последнего. Все эти микроорганизмы могут быть продуцентами при том условии, что они мутированы по следующему двухстадийному методу селекции: 15 а) микроорганизмы, выращияаемые на бетаине, у-бутиробетаине, кротонобетаине и L-карннтине в качестве источника углерода и азота, мутируют известными приемами; 20 б) из культуры мутированных микроорганизмов, полученной в результате процесса культивирования, селекцноиируют устойчивые микроорганизмы, не разлагающие L-карнитина и выращнвае- 25 мые на бетяине., кротобетаине, у«бутиробетаине. Выращивание штаммов, растущих на бетаине, кротонобетаине, Реакция по Граму
Споры
Образование поли-роксибутирата оксидазы каталаэы .
Рост в анаэробных условиях
37 С
410С рН 5,6 на агаре MacCorkey на агаре SS на цетримндном агаре у-бутиробетаине в качестве источника углерода и азота, осуществляют путем посева смеси бактерий на. кротонобетаиновые питательные растворы, приготовляют таким образом смешанные культуры, а затем по традиционным микробиологическим приемам получают чистые культуры разлагающих кротонобетаин микроорганизмы. Мутацию куль» тур, растущих на «-бутиробетанне, кротонобетаине в качестве источника азота н углерода, осуществляют известными методами. Мутированные таким образом микроорганизмы подвергают селекцнонированию, Микроорганизмом растущим на бутиробетаине или кротонобетаине в качестве источника углерода и азота, является штамм HK 4 (РЗИ Ф 2938) и его десценденты и мутанты. Этот штамм 03.03.84 за Р DSN 2938 был депонирован при Немецкой коллекции мик-. роорганизмов (Deutsche А$ашш1и68 von
Nikroorganismen (DSN) при обществе
Сезе11schaft fur Biotechnologische
Forschung шЬН, Griesebachstrabe, 8
4300 Gottingen, ФРГ).
828
Реакция Фогес-Проскауера
Образование индола нитрата иэ нитрата
Денитрификацня
Образование левана лецнтиназы уреазы
Деградация крахмала желатина каэеина тир озина твина 80
ДНК э скули на t 435 159 нитрата малоната глицина .норлейцина ксилозы фруктозы глюкозы
Автотрофный рост на Н
3-кетолактоза
Рост на бетаине
L-карнитнне -бутиробетаине кротонобетаине
И кроорганизмом, полученным в ре- штамм 23.01.84 был передан общестэультате мутации и селекцнонирования ву Gesellschaft fear Biotechnologische из указанного микроорганизма, который Tnrsehung mbH, briesebachstrabe 8,. обладает устойчивостью, не, разлагает 2б 4300 G5ttingen, ФРГ, на хранение за
Ь-карнитина, а вселяет его и растет М DSM 2903 в коллекции Deutsche Samна кротонобетаинеили 1-бутиробетаине, - mlung von Mikroorganismen (DSM) . является штаммАдгоЬасйег ши НК 13.Этот
Описание штамма Agrobactererium HK 13 (DSM В 2903) Образование феннлаланнндеаминазы орнитиндекарбоксилаэы
Форма клеток палочки частично плеоморфны .1-2
0,5-0,8
Длина, мкм
Ширина, мкм
Подви:кность
Жгутиковые перитрихаль" ное
Реакция по Граму
Споры
Образ ова ние поли-я-ок сибутира оксидазы каталаэы
Рост
Деградация крахмала: в анаэробных условиях
37 С
41 С рН 5,6 на агаре MacCoukey на агape SS на цетримидном агаре желатина каэеина тирозина твина 80
ДНК эскулина
Пигменты не диффундирующне диффундирукщие флуоресцирующие
Образование кислоты (тест "OF" ) из глюкозы аэррбно анаэробно фруктозы аэробно
ASS глюкозы ксилозы трегалозы этанола.
Образование газа из глюкозы
ONPG
Образование аргининдигйдролазы лизиндекарбоксилаэы
Н Я
Реакция Фогес-Проскауера
Образование индола нитрита из нитрата
Денитрификация
Образование левана лецитиназы уреазы
1435t59
Продолжение колонки 1
Продолжение колонки 2
Описание штамма Agrobacterium НК t331 (DSN И 3225):
Образование фенилаланиндеаминазы орнитиндекарбокси- лазы ну
Реакция Фогес-Проскуера
Образование и идола нитрита из нитрата
Денитрификация
Форма клеток палочки частично плеоморфны
1-2
О, 5-0,8
+ перитрихальное
Длина, мкм
Ширина, мкм
Подвижность
Жгутик о ва ни е
Образование левана л е цити назы уреазы
Деградация. крахмала желатина казеина
Пигменты не диффундирующие диффундир ующие флуоресцирующие
Образование кислоты (тест "OF" ) из глюкозы аэробно анаэробно фруктозы аэробно
ASS глюкозы ксилозы трегалозы этанола
Образование газа из глюкозы
ONPG
Образ ование аргининдигидролазы лизиндекарбоксилазы
Примером устойчивого десцендента микроорганизма НК 13, не разлагающего, a выделяющего L-каринтии и растущего на бетаине, Ь-глутамате и кротонобетаине, L-глутамате и бутиробетаине, глутамате и L-карнитине является штамм НК 1331. Его выделяли в виде спонтанно и хорошо растущей ко" ловки мутантов с поверхности плотной
Реакция по Граму
Споры
Образование поли- — оксибутирата оксидазы каталазы
Рост в анаэробных условиях
37 С
41 С рН 5,.6
Использование субстрата ацетата цитра та . малоната глицнна норлейцина ксилозы фруктозы глюкозы
Автотрофщый рост на Н
3-кетолактоза
Рост на бетаине
L-карнитине у-бутиробетаине . кротонобетаине т
L-глутамате и кротонобетаине
? -глутамате и бутиробетаине
L-глутамате и
L-карнитине
I агаровой питательной среды, содержащей L-глутамат и р-бутиробетаин.
Указанный штамм 08.О2.85 был передан обществу Ьезе11scaft fur Biotechnologische Forschung mbH, briesebachstrabe 8, 43ОО, Со Ыцеп, ФРГ9 на хранение за 0 DSN 3225 в коллекции
Deutsche Sammluag von Nikroorganismen (DSN) . г
Продолжение колонки 1 на агаре ИасCoukey на агаре SS на центримидном агаре
Пигменты не диффундирующие диффундирующие флуоресцнрукицие
Образование кислоты (тест "OF" ) из глюкозы аэробно анаэробно фруктозы аэробно
ASS глюкозы ксилозы трегалозы этанола
Образование газа из глюкозы
0NPG
Образование. ар гининдигидролазы лизиндекарбоксилазы
I 435I 59
Продолжание колонки 2 тир озина твина 80
ДНК эскулина
Использование субстрата ацетата цитрата малоната глицина норлейцина ксилоэы фруктозы глюкозы
Автотрофный рост на Нт
3-кетолактоза
Рост на бетаине
L-карнитине, -бутиробетаине кротснобетаине
L-глутамате и кротонобетаине
L-глутамате и бутиробетаине
L-глутамате и L-Kzpнитине
В целях осуществления предлагаемого способа получения L-карнитина целесообразно сначала выращивать предварительную культуру микроорганизма на стерилизованной среде при
20-40 С при рН 6-8 в течение 20-50 ч.
Эта предварительная культура должна содержать в качестве субстрата роста
О, 1-10 мас.Х g-бутиробетаина и кроI . тонобетаина, считая на реакционную среду. 3 -Бутиробетаин или кротонобетаин можно использовать в виде гидрохлоридной соли, свободной внутренней соли или их производных. С помощью приготовленных по данному способу предварительных культур можно засевать питательные среды. Последние должны иметь такой же состав, что 0 и предварительные культуры посевного материала. Концентрация подвергаемых реакции крстонобетаина, т-бутиробетаина или смесей этих соединений в питательной среде О, 1-10 мас.X. Субстраты роста — холин, глутамат, ацетат, диметплглицин и бетаин — целесообразно применять тожЕ в концентрациях, соответствующих концентрациям в предварительной культуре.
Клетки можно отделять центрифугированием или фильтрованием и использовать в качестве посевного материала для приготовления новой культуры.
Образовавшийся L-карнитин путем катионообменной хроматографии выделяют из всплывающей жидкости и очищают перекристаллизацией.
Пример 1 ° Выделение разлагающего кротонобетаин микроорганизма.
Из почвы нейтральным раствором фосфатного буфера с перемешиванием извлекают микроорганизмы с последующим отделением крупных компонентов через фильтровальную бумагу. С помощью полученной таким образом смеси бактерий засевают питательный кротонобетаиновый раствор до легкого помутнения. Через 9 сут помутнение, являющееся мерой концентрации клеток, увеличилось в 90 раз. В результате кротонобетаин в растворе уже не обнаэ живался и в нем в качестве про143515
9 ухта деградации докаэывались аммоевые ионы, Из укаэанной смешанной
« льтуры, прибегая к традиционным
« икробиологическим приемам с исполь5 ованием плотной агаровой питатель" ой среды, приготовляют чистые кульуры разлагающих кротонобетанн «йкроганизмов. Для проведения дальнейх работ иэ них выбирают культуру, 10 бозначаемую Agrobactererium НК 4. от штамм растет на у-бутиробетаи-. е, L-карнитине и бетаине.
П р и и е р 2. Выделение устойчи; ого не содержащего дегидрогенаэу арнитина иутанта.
Культуру штамма Agrobactererium
4 с помощью мутагена Acridin Nu"
agen ICR191 (5 икг/ил) в сукцннат-. ой среде подвергают стабильной му- 20 агенизации, после чего клетки s цех экспрессии мутацни выращивают на тательном бульоне, затем переводят бетаиновую среду. Проиытую культуВносят в L"карнитиновую средуе 25 же через несколько часов культура, ступала в логариф«кческую фазу роса. В это вреия добавляют пенициллин (t5 .иг/ип) и D-цяклосерин
0,5 иг/ип), которые в качестве провоселекцнонирующих агентов уиерщвап только растущих бактерий, В результате выкивания накапливались иуанты, которые не могли расти на
-карнити««е, Через 30 ч число живых клеток сокращалось в 100 раз. После
35 от«ывки антибиотиков культуру переводят в бетаиновую среду. Выросшую культуру разбавля1от и распределяют .на плотной питательной среде. Отдель ные клетки вырастали с образованиеи, колоний и. в отдельности подвергались, испытанию. В результате выбирают мутант Agrobactererium НК 13. Последний устойчив, не содержит дегидрогенаэы карнитина и растет на бетаине.
Прорастая на бетаине, дииетилглицине, холине, глутамате или ацетате, этот штаим превращает кротонобетаин или 1.-бутиробетаин в ?-карнитин и выделяет его.
Пример 3. Предварительную культуру штамма Agrobactererium НК 13 объемом 5 мл культивируют в течение
32 ч при 30 С и рН 7,0 в витаиинсодержащей минеральной среде, содержа- 55 щей 1 мас.Х бетаина и 0,5 мас.Х кротонобетаин-хлорида. Эту культуру эасеивают в культуру того же состава объемом 15 л, которую потом выращивают в течение. 24 ч в условиях, указанных для предварительной культуры.
По прекращении получения Ь-карннтина удаляют клетки центрифугированием и применяют их затем в качестве посевного иатериала для приготовления новой культуры. Энзиматическим анализом определяют концентрацию L-карнитина во всплывшей жидкости (19,8 л).
Содержание L"карнитнна во всплывшей жидкости 4,26 мг/мл, что составляло по выходу 95 ОХ. Путем катионообменной хроматографии выделяют Lкаринтии из всплывшей зядкости и очищают его перекристаллизацией.
П р и и е р 4, Предварительную культуру штамма Agrobactererium НК 13 объемом 5 л культивируют в течение
32 ч при 30 С и значении рН 7,0 в витамннсодержащей минеральной среде (по прииеру 1), содержащей 1Х холина и 0,6X « -бутиробетаин-хлорида. Эту культуру эасеивают в культуру со средой того же состава объемом 15 л, которую потом выращивают в условиях примера Ф. По прекращении получения
Ь-карнитина (примерно через 30 ч) отделяют клетки методом макрофильтрацние Клеточную массу используют для дальнейшего получения Ь-карнитина.
Концентрацию L"êaðíèòèía в фильтрате (19,6 л) определяют энэиивтическим анализои. Содержание L-карнитина в фнльтрате 5,3 иг/мл. Это соответствовало аналитическому выходу в 97,6Х, считая на использованное количество
g-бутиробетаин-хлорида..
Пример 5. Предназначенный с для приготовдения непрерывной культуры ферментер, содержащий 1,5 л вита«внсодержащей «янеральной среды (по примеру 1) с 1,5Х бетаина и 1„0X у-бутиробетаин-хлорида, загружают
150 ип предварительной культуры Agrobactererium НК 13 на той же-среде.
После азробного выращивания в течение 20 ч при 30 С и рН 7,0 культура достигала полного роста. Потом клейки отделяют путем центрифугирования.
Согласно энэиматическому анализу всплывшая жидкость содержала 8,8-г
Ь-карнитина на литр культуры.
Следует отметить, что количество
0,1-10Х является существенным, так как только в этом случае достигается повышение выхода. При количествах
l 4351 59
12 выше 103 будет иметь место осмотическое давление клеток.
Данный способ позволяет повысить выход L-"êàðíèòèíà íà 15X.
Формула изобретения
Составитель Е. Буданцева
Техред M.Ìoðãeíòàë Корректор С.Шекмар
Редактор О.Спесивых
Заказ 5569!59
Тирах 520 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений н открытий
113035, Иосква, Ж-35, Раутская наб., д. 4/5
Ф««Ю«ЮЮЮ Ю ЮЮ Ю Ю Ю
Производственно-полиграфическое предприятие, г. Уагород, ул. Проектная, 4
Способ получения L-карнитина, предусматривающий выращивание бактери- 10 ального штамма-продуцента на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода и азота т-бугиробетаин или кротонобетаин, факторы роста в условиях аэрации до максимального накопления целевого продукта с последующим его выделением, отличающийся тем, что, 1 с целью повышения выхода L-карниткна, в качестве бактеркального штамма-продуцента используют Agrobacterium
НК 4, кли Agrobacterium НК 13, или
Agrobacterium НК 1331, при этом бутиробетаин нли кротонобетаин вводят в количестве от 0,1 до 10,0Х.
