Способ получения антибиотика ср-63517,используемого в качестве кормовой добавки для крупного рогатого скота и свиней

 

Изобретение относится к способу получения нового кислотного полициклического эфирного антибиотика СР-63517. Целью изобретения ется повьшение эффективности способа . Способ заключается в следующем: проводят культивирование Streptomyces endus, subsp, iaureus ATCC-39574 на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и неорганические соли, при 24-26 С с последующим вьщелением антибиотика в виде катионнрй соли общей формулы. СО

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (59 4 С 12 Р 1/00

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

llO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

1.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ " 3, Н flATEHTY %ф

1 —

f (21 ) 3857495/30-13 (22)C 15.02.85. (31) 581384 (32) 17.02.84 (33) US (46) 15.10.88. Бюл. У 38 (71) Пфайзер Инк (US) (72) Уолтер Даниэль Селмер, Уолтер

Патрик Куллен (US), Хитоси Маеда и Дзунсуке Тоне (УР) (53) 615,779.9(088.8) „, SV„„1431682 А Ъ (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА

СР-63517, ИСПОЛЬЗУЕМОГО В КАЧЕСТВЕ

КОРМОВОЙ ДОБАВКИ ДЛЯ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА И СВИНЕЙ. (57) Изобретение относится к способу получения нового кислотного полициклического эфирного антибиотика

CP-63517. Целью изобретения явля - ется повышение эффективности способа. Способ заключается в следующем: проводят культивирование Streptomyces

endus, subsp, аш еив ATCC-39574 на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и неорганичео ские соли, при 24-26 С с последующим выделением антибиотика в виде катионной соли общей формулы.

1431682 новый антибиотик относится к кислотным полициклическим эфирным (ионофорным) антибиотикам.

Целью изобретения является новый антибиотик, обладающий высокой эффективностью в качестве кормовой добавки для крупного рогатого скота и свиней и имеет химическую формулу. лл

0Ре

5

Ие

31

Ne

ЗО

Н20Н

39 38 где Ме СН ъ

Его катионные .соли активны против различных микроорганизмов и эффективны при борьбе с кокцидозом, энтериtoe, дизентерией у свиней и тейлерио- 30 зом, а также эффективны для ускорения роста у свиней и жвачных животных, а также для повьппения эффективности усвоения пищи свиньями и рогатым скотом.

Штамм Streptomyces endus, subsp, 4ureus депонирован в Американской коллекции типовых культур (АТОС) под номером 39574. о

Культуру инкубируют при 28 С и по40

: лученные результаты проверяют в различные моменты времени, но обычно спустя 14 дней. Окраску описывают в обычной терминологии, но точные цвета определяют путем сравнения с

45 цветными пластинами Color Harmony

, Manual четвертого издания.

Для идентификации используют следующие среды.

Экстракт трицтон-дрожжевого бульона 1SP ф 1-я среда).

Агар на экстракте дрожжей-экстракте солода (ISP 2-я среда, Di f co ) .

Агар на отваре из овсяной муки (USP = Зя среда, Difco}.

Агар на смеси неорганические соликрахмал (ISP ф 4-. я среда, Difco}.

Агар на смеси глицерин-аспаратин (ISP, = 5-я среда, Difco).

Изобретение относится к способу получения нового антибиотика, обозначенного как CP-63517, который был выделен при ферментации нового штамма рода Strepromyces, выделенного из образца почвы, отобранного в префектуре Окаяма в Японии, и которому присвоен кодовый номер В 497-34. Этот

Агар на смеси пептон-дрожжевой экстракт-железо (ISP = 6-я среда, Difco).

Сахарозный агар S.А . Waksman.The

Actinomycetes, Vol 2 среда Ф 1, с,328, 1961.

Глюкозо-аспарагиновый агар, там же среда Р 2, с. 328.

Агар Беннета, там же, среда Ф 30, с, 331.

Агар Эмерсона, там же, среда У 28, с. 331 °

Питательный агар, там же, среда

У 14, с. 330.

Тирозиновый агар Гордона и Смита—

R. Е. Gordon and М.М. Cmith, J. Bact

69, с. !47- 150 (1955).

Казеиновый агар, там же.

Агар кальций малата — S.A. Warksman, Bact. Rev. 21, 1-29 (1957). Желатин — R. Е. Gordon and.

I М. Mihm, Т. Bact 73, с. 15-27 1957) .

Крахмал, там же.

Органический питательный бульон, там же.

Декстрозный питательный бульон—

S.A. Waksman The Actinomycetes, vol 2, среда В 1, с. 328, 1961, с добавлением 30 г сахарозы вместо 3 r декстрозы и без агара.

Агар на картофеле и моркови—

М.P, Lechevalier, J. Lab. апй С1inical Med.. 71, с.934-944 (1968), но

1431682

15 используют только 30 r картофеля, 2,5 г моркови и 20 г агара.

f 1

2Х-ный агар на водопроводной воде.

Снятое молоко — Difco.

Продукты переработки целлюлозы: а) H.L. Jensen. Proc. Lenn. $ос.

N.S.W. 55, 231-248 (1930). в) М.Lenine and М.W.Schocnlein компилляция культуральной среды, среда У 2511, 1930.

Углеводы — I P, 9-я среда, Disco.

Температурный интервал — I P 2-я среда плюс 50 мл кокосового молока на литр среды.

Морфологические характеристики.

Морфмологические характеристики прослеживают на агаре из овсяной муки после 14 дней инкубирования: масса спор в серых колористических 20 сериях,спорофоры разветвлены моноподно цепи спор спирального малого диаметра (3-4 мкм), слега открытые, от 3 до 7 поворотов на цепь спор, от 10 до 50 спор на цепь спор, споры 25 коротки палочкообразные, иногда глобулярные, овальные или эллиптические, прямые или слегка искривленные, причем некоторые из слегка искривленных с непараллельными концами и образуют 30 пятиугольник 1,0-1,8 0,9-1,2 мкм или 0,9-1,2 мкм диаметром. бородавчатые по данным электронной микроскопии, Биохимические характеристики.

Меланин не продуцирует, сероводо- род продуцирует, желатин ожижает, крахмал гидролизует, нитрат восстанавливает до нитрита, хороший рост на бульоне на целлюлозе Левина и Шо- 40 энлейна, но плохой рост на бульоне на целлюлозе Йенсена, нет разложения на обоих бульонах на целлюлозе, коагулирует и просветляет на молоке усваивает казеин; усваивает 45 малаты, кальций не усваивает тирозин. Усваивает углеводы: глюкозу, арабинозу, фруктозу, инозитол, маннитол, раффинозу, рамноэу, сахарозу и ксилозу. о

Температурная зависимость: 21 С— хороший рост, 28 С вЂ” отличный рост, 37 C — хороший рост, 45 С вЂ” умеренный рост.

Новый антибиотик получают ферментацией нового штамма Streptomyces

endus. зцйзр, aureus ATCC-39574 и экстракцией полного бульона при естественном рН метилизобутилкетоном и концентрированием растворителя до получения вязкого масла. Это масло суспендируют в гептане и порциями обрабатывают на силикагеле. Лепешку силикагеля элюируют хлороформом, смесью хлороформ (этилацетат, этилацетатом и смесь этилацетат} ацетат.

После концентрирования из этипацетатной фракции получают небольшое количество неочищенного продукта, из которого перекристаллизуют антибиотик

CP-63517 в виде смеси солей натрия и калия. Streptomyces. endus.subsp, auceus АТСС-39574 выращивают при температуре от 24 до 36 С в погруженных условиях при перемешивании и аэрации на .среде, состоящей из таких источников углеводов, как сахара, крахмал, глицерин, таких веществ, содержащих органический азот, как соевая мука, казаминовые кислоты, экстракты дрожжей; из таких ростовых веществ, как растворимые части зерна, рыбная мука, мука хлопковых семян, из минеральных солей, содержащих следовые количества таких элементов, как железо, кобальт, медь, цинк и карбонат кальция или фосфаты в качестве буферирующих агентов. Антибиотик можно выделить экстрагируя полный бульон различными органическими растворителями, например, н-бутанолом, метилизобутилкетоном или хлороформом. Неочищенные формы антибиотика PC-63517 или высушенный ферментационный бульон, содержащий антибиотик, можно вводить в кормовые композиции в нужных концентрациях.

Пример. ! Выделение антибиотика CP-63517 из ферментационного бульона,1

Полный бульон из 10 сосудов ферментации культруры АТСС-39574 (полный объем приблизительно 25 л) экстрагируют половиной объема метилизобутилкетона. Полученный экстракт концентрируют в вакууме до получения коричневого масла (20 г}. Этот материал хроматографируют на колонке 5 !00 см заполненной силикагелем хроматографической степени чистоты в этилацетате.

Колонку проявляют этилацетатом со ско. ростью 10 мл/мин. Отбирают фракции по 10 мл. Затем эти фракции исследуют с помощью тонкослойной хроматографии на пластинах силикагеля с проявителем этилацетатом. Затем пластины опрыскивают З -ным ванилином в этано1431682 изобретения

Формула

7, ОИе й

31

Ие

Я ОН

ВНИИПИ Заказ 5358/59 Тираж 520

Подписное

Произв.-полигр. пр-тие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

1 ле — 85% фосфорной кислотой (3:1) и нагревают до 80 С. Целевой антибиот к CP"63517 появляется в виде зеленого пятна в этих условиях. Фракции, содержащие CP-63517, объединяют (полн1 и объем приблизительно 300 мл) и перемешивают с 2 r угля Darco G 60" в течение 15 мин. Полученную смесь фильтруют и полученный фильтрат перемешивают с 300 мл 5%-ного натрийсфатного двухосновного буфера, а р устанавливают 10,0 1 н. NaOH, Фаз 1 разделяют и этилацетат сушат над б зводным сульфатом натрия, фильтр т и выпаривают в вакууме. Желтое в1 зкое масло, оставшееся после выпаривания, растворяют в небольшом объеме ацетона, после чего происходит кристаллизация.

Кристаллы собирают фильтрованием

Hiсушат в вакууме, в результате чего получают 809 мг CP-63517 в виде натриевой соли, т.пл. 215-220 С, ИК спектр (КВг) см : 3436, 2964, 2928, 2871, 2728, 1666, 1563, 1462,.

1404, 1372, 1319, 1293, 1271, 1234, 1205, 1167, 1100, 1050, 1033, 995, 980, 967, 940, 926, 902, 858, 538, Оптическое вращение oL/D = +25 (С = 0,5 метанол).

Рассчитано, %: С 63,49; Н 8,89;

N 0,0.

С4т Н 01411а

Найдено, %: С 62,45;, Н 8,61;

N: 0,0 x

ICl America, inc. Wilmingron, Delaware, 19899.

СР-63517 в форме свободной кислоты получают, перемешивая флороформовый раствор СР-63517 с :эквивалентным объемом воды и понижая рН до 3,0 фосфорной кислотой ° Фазы разделяют и хлороформ выпаривают в вакууме до получения свободной кислоты CP-63517 в виде аморфного твердого вещества с

10 т.пл. 95-105 С, УФЗ „,, 232

ИК-спектр (КВг) см: 3474, 2968, 2832, 2877, 1715, 1670, 1460, 1380, 1315, 1265, 1233, 1202, 1165, 1113, 15 1099, 1066 1046 1021 987 950, 923, 900.

Оптическое вращение: Ы/D = +47,4 (С = 0,5 метанол).

20 Рассчитано, % С 65,10, Н 9,07

0 25,83.

С4> Н та0 4

Найдено, %: С 64 05, Н 8,93

0 27,03 .(по разности).

Строение CP-63517,подтверждено данными 1Н-ЯМР и масспектром высокого разрешения.

Способ получения антибиотика

СР-63517, используемого в качестве кормовой добавки для крупного рогатого скота и свиней, заключающийся в культивировании штамма актиноми6 цета АТСС N 39574 на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и неорганические соли, при 2436 С с последующим выделением анти40 биотика в виде катионной соли общей формулы