Способ получения гетерополисахарида
Изобретение относится (технологии и касается способа получения ксантанового гетерополисахарида, который может быть использован в качестве эффективного агента в пищевых продуктах, косметике и т.д. Целью изобретения является повышение выхода и улучшение физико-химических свойств полисахарида. Способ заключается в выращивании нового штамма Xanthomenas campestris NCIB 11854, который обладает высокой скоростью роста и биосинтетической активностью и способен накапливать порядка 14 г/л полисахарида. 6 табл.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
0% (И) А3
®CEC@H)appal 1
1 1
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К IlATEHTY
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3753904/28-13 (22) 28.06.84 (31) 8317696 (32) 29.06.83 (33) GB (46) 15.04,88. Бюл. № 14 (71) Шелл Интернэшнл Рисерч Маатсхаппий В.В. (NL) (72) Джон Дэвид Даунз (GB) (53) 663, 15(088.8) (56) Патент США № 3485719, кл. 195-31, 1969 ° (54) СНОСОВ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕТЕРОПОЛИСА (АРИЦА (51)4 С 12 Р 19/06, С 12 N 1/20//
//(С 12 N 1/20, С 12 R 1:64) (57) Изобретение относится к биотехнологии и касается способа получения ксантанового гетерополисахарида, который может быть использован в качестве эффективного агента в пищевых продуктах, косметике и т,ц. Целью изобретения является повышение выхода и улучшение физико-химических свойств полисахарида. Способ заключается в выращивании нового штамма
Xanthomenas campestris NCIB 11854, который обладает высокой скоростью роста и биосинтетической активностью и способен накапливать порядка 14 г/л полисахарида. 6 табл.
1 i389bH:3 2
Изобр тение относится к биотехнологии и касается способа получения ксантанового гетерополисахарида, который может быть использован в качестве эффективного агента в операциях по вторичной регенерации масел, за" густителей в пищевых продуктах, косметике и т.д. и также в качестве агентов, способных образовывать съедобную пленку, и в качестве эмульгирующего агента, например, в чернилах для печатания, а также в качестве загустителя в пастах для печатания в текстильной промышленности, 15
Целью изобретения является увеличение выхода и улучшение физико-химических свойств полисахарида.
Новый штамм; Xanthomonas campestris депонирован в Национальной Коллекции 0
Промьлпленных Бактерий, Торри Рисеч
Стейшн, Абердин под номером !1854, Ытамм 11СХВ 11854 демонстрирует более высокую скорость роста в синтетической солевой среде, значительно более высокую специфическую скорость производства полимера и его можно выращивать как в непрерывных условиях, так и периодических.
Национальная Коллекция Промышлен-. 30 ных. бактерий располагает также штаммом ИСХВ 11803 который обладает ,сходными признаками со штаммом МСХВ ! 1854,, Морфолого-культуральные и физио35 лого-биохимические признаки штамма.
Морфолого-культуральные признаки, A. Окислительный питательный бульон
СМ1 + 0,751 arapa Дифко инокулировали молодыми выросшими микроорганизмами 4 и ипкубировали в течение 7,5 ч при
25 С. Клетки с пятен размером выросшей культуры 0,2 мм исследовали и фо. тографировали на месте (in situ) при фазовом контрасте со скользящей диаф45 рагмой. Подвижность и другие характеристики определили в пулах, окружающих О, 1 р м стеклянные шарики, расположенные на других пятнах. Клетки на краях выросшей культуры встречались по одной и парами, при этом размер
50 клеток составляет: ширина 0,4-0,5р и и длина 1,2-2,5 р м для NCIB 11803 ширина 0,5-0,6 1м и длина 1,2-2,5 1.м для NCIB 11854. На полях выросших культур в пулах видны агрегаты, сос55 тоящие по количеству от сотен до нескольких тысяч клеток с NCIB 11803, но намного реже с ЯСТВ 11854. МобильПитательный бульон
Р 2 (Оксоид)
Желатина (Дифко)
Желатиновые чашки.X:
11итательный агаровый оксоид СМЗ
Желатина
Молочные чашки, /:
Снятое молоко (Дифко), отдельно стерилизованное
Пептон (Дифко)
Экстракт ветчины
LabLemco О,1
NaCI 0,5
Агар 1,5 рН 7,4 до автоклавирования
2,5 i 2,0
2,8
i,0
3,0
0,1 ность положительная. При использовании условий, как в А, но с добавлением 0,5Х глюкозы в среду и инкубированием в течение 7 ч, получили аналогичные результаты, за исключением того, что клетки были на О, 1 р м шире и не были видны агрегаты с NCIB 11854.
Б. После выращивания в течение
48 ч при 30 С в чашках с окислительным питательным агаром СМЗ наблюдали хороший рост, выделенные колонии желтого цвета, круглые, целые, слизистые, гладкие, волокнистые и выпуклые. Диаметр колоний для 11803
1-1,5 мм для NCIB 11854 1,5 мм.
В. Спустя 72 ч после начала выращивания при 30 С »а среде, аналогичной в А, но с добавлением 17 глюкозы, рост был хорошим, выделенные колонии бледно-кремового цвета, круглые, целые, очень слизистые, гладкие и выпуклые, в то время как выросшие слившиеся колонии желто-кремового цвета.
Диаметр колоний для NCIB 11803 2 мм и для 11854 2,2,5 мм.
Селективная морфология. Минеральное основание Паллерони 6 Доудорофф
1972 модифицированное (PD), г:
NagНР0 12H) О 6,0
КНРО 2,4
NH,С1. 1,0
М8804 7Н О 0,5
FeCI з. 6Н О 0,01
СаС1 . 6Н О 0,01
Деионизированная вода До1л рН 6,8
PD минеральное основание + 0,1X фильтро- стерилизованная глюкоза (РРЬ), желатиновый столбик, /:
1389683
Биохимические характеристики: при
30 С за исключением особо оговоренных случаев, рост при 0 С на СМ3 чашках:
Температура, С 5 3 37
Рост (не количественный) + +
Интервал роста рН íà CMl буль10 оне (выверенный рН) рН 35728910
Рост 3+ 3+ 3+ 3+ 3+
Рост в присутствии соли. Основная среда, содержащая NaC1 в концентрации
2,3,4 и 5%, приготовлена в соответствии со способом по Хейварду и Ходжкису. Культуры инкубировали в течение
3 дней.
NCIB 11854 менее терпим к соли, чем NCIB 11803.
NaCl, 7 2 3 4 5
NCIB 11803 рост 3+ 3+ 3+
NCIB 11854 рост 3+ 3+ +
Гидролиз желатины и казеина.
Культуры инкубировали в течение
7 дней. Желатиновые столбики содержались при 20 С. NCIB 11854 показал меньшую степень протеолитической активности, чем NCIB 11803 (см. табл.1).
Тесты на требования факторов роста, Субкультуры подготовили в виде прямой проволоки трижды в среде PDG c дистиллированной водой на стекле.
Получили удовлетворительный рост через 4 дня, при этом особых требований к факторам роста не было.
Тест на стимулирование метионимом.
Одну каплю слегка мутной молодой выросшей культуры в среде PDG с дистиллированной водой на стекле инокулировали в PDG с и без 10 / г/мл L-метионином в 1 мл в 16 мм трубках. Факта стимуляции скорости роста L-метиони45 ном не наблюдали.
Использование источника углерода.
Среду PD с одними источниками углерода (О, 1X), стерилизованными с фильтром (табл. 2), инокулировали и инкубировали в течение 14 дней. Обна- 50 ружили слабые расхождения в скоростях роста между штаммами.
Получение кислоты из углеводов.
К окислительно-ферментационной среде Хейварда и Ходжкиса добавили 1Х 5 стерилизованных с .фильтром источни- ков углерода, приведенных в табл. 2
L (знак + — вместо DL) . Трубки инокулировали и инкубировали в течение
14 дней. Кислоту получали Н3 галакто.,зы и мелибиозы с помощью NCIB 11854, но не NCIB 11803.
Грамотрицательные неферментативные вещества даны в табл. 3.
Приведенные данные свидетельствуют о том, что штамм 11854 демонстрирует лучшую кинетику производства полимера в определенной среде, лучший: рост с неорганическим азотом (в особенности NH +) и стабильность в неФ прерывной культуре в синтетической солевой среде.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример. Xanthomonas campestris
NCIB 11854 выращивают.на трех различных химических синтетических солевых средах (табл. 4) в сосуде емкостью 7 л, в циклических условиях.
В первом эксперименте единственным источником азота для роста микроорганизмов служит ион аммония (24 мИ), позволяющий достичь экспонентного роста клеток до максимальной концентрации 3 г/л.
Во втором и третьем экспериментах аммоний заменяют нитратом (24 мМ) и глютаматом (24 мМ) соответственно.
Результаты приведены на фиг. 1-3.
Как видно из сравнения схем по фиг. 1-3, глютамат как источник азота является наиболее предпочтительным, поскольку он дает р макс, т.е. максимальную скорость роста клеток
О, 12 ч ", qn величину, т.е. специфическую скорость производства полимера в 0,36 г (г ") ч и конечный выход полимера В 0,59 гл . Эта комбинация высокой макс и высокой qn дает продуктивность полимера в .итоге 0,49 r (1 ) ч, что вдвое больше обычной продуктивности гетерополисахаридной ферментации с использованием Xanthomonas campestris МИБ.В-1459.
На табл. 5 (А) приводится р макс, qn, гг, т.е. специфическая скорость расхода глюкозы, В д — выход полимера на глюкозе и П вЂ” полимерный продукт для Xanthomonas campestris NCIB
11854, в определенной выше ростовой среде с солями и (В) — соответствующие величины для Xanthomonas campestris NRRL В-1459.
Условия роста для культуры Xanthomanas campestris NCIB 11854 следующие:
Температура, С рН
Импеллер
1389683
28
6,8
Турбина Раштона с лопастями 3 4
1,0
20,0х10 з
10, Ох10
10х10
l0x10
До!л
Таблица
Штамм
NCIB 11803 +
NCIB 11854
+ слабый 1
Скорость импеллера, об/мин 1000
Объем культуры, л 4,5-5,0 рН контроль 1N Na0H+1N КОН
Давление растворенного О 80 мм Hg
Скорость потока воздуха, л/мин 1,0
Как видно из табл. 5, улучшилось действие Xanthomonas campestris NCIB
11854 в сравнении с Xanthomonas
campestris NRRL В-1459.
В табл. 6 даны сравнительные данные фильтрационной способности Xantho-20
monas campestris 11854 бульона с фильтрационной способностью Xanthomonas campestris ЯКИ В-1459 бульона при раэбавлении до постоянной вязкости в растворах различной солевой 25 концентрации. Фильтруемость растворов . с вязкостью 20 сИэ (вязкость измерена при коэффициенте сдвига 7,5 с " ).
Для фильтрации используют фильтры
"Миллипор" (торговая марка), имеющие диаметр 47 мм 5 ри 1,2 р — размеры пор. Как видно из табл. 6, фильтруемость бульона с Xanthomonas campestris NCIB 11854 до и после знзимати" ческой обработки значительно лучше, 35 чем у известного.
Формула изобретения
Способ получения гетерополисахари-40
1 да, предусматривающий выращивание микроорганизма-продуцента вида Xanthomonas campestris на питательной среде, содержащей в качестве источника углеРода глюкозу, источники азота, фосфо- 45 ра, минеральные соли и воду, в условиях аэрации и перемешивания до максимального накопления целевого продукта и последующее его выделение, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода и улучшения физико-химических свойств гетерополисахарида, в качестве микроорганизма-продуцента используют штамм Xanthomonas campestris NCIB 11854, при этом в питательную среду в качестве источника азота вводят глютамат натрия, минеральных солей — хлористый кальций двуводный, серно-кислые магний, железо (II), марганец, цинк семиводные, серно-кислую медь пятиводную, хлористый кобальт шестиводный, молибденовокислый натрий двуводный, йодистый калий и борную кислоту при следующем соотношении входящих в нее ингредиентов, г/л воды:
Глюкоза 23,4
Глютамат натрия 24,0
Фосфорно-кислый калий однозамещенный 25,0
Фосфорно-кислый натрий двузамещенный 25,0
Хлористый кальций двуводный
Серно-кислый магний семиводный 2,0
Серно-кислое железо (II) семиводное 0,2
Серно-кислый марганец семиводный 20,0х10
-3
Серно-кислый цинк семиводный
Серно-кислая медь
3 пя тиводная 20,0х10
Хлористый кобальт з шестиводный !0,0х10
Молибденовокислый натрий двуводный
Йодистый калий
Борная кислота
Вода
Желати- Желати- Молочная новый новая чашка столбик чашка
1389683
Таблица2
Рост на одном источнике углерода
Углерод и произ- Производство кисловодные сахара ты иэ О- F среды
NCIB NCIB
11803 11854
NCID NCIB
11803 11854
Рибоза
Ксилоэа
Следы
-Слабый Слабый
Арабиноза
Слабое Слабое
Рамноза
Глюкоза
Фруктоза
Сахароза
Трегалоэа
Целлобиоза
Слабое +
2-Кетоглюконат
Сахарат
Жирные кислоты
Ацетат
Слабый Слабый
Пропионат
Бутират
Дикарбоновые кислоты
Иалонат
Слабый +
Оксикислоты
D(-)-тартрат
Мезо — тартрат
DL-3-гидроксибутират
DL-лактат
Глюколлат
Другие органические кислоты
Левупинат
Цитраконат
1389683
Продолжение табл. 2
Углерод и и водные саха ои исерода
854
Мезаконат
Сахарные спирты и гликоли
Эритрит
1 Сорбит
Мезо-инозит
Адонит
Пропиленгликоль
2,3-Бутиленгликоль
В-Маннит
Спабое +
Слабый
Глицерин
Спирты
Метанол
Слабый
Этанол
Гераниол
Беэазотные ароматические и другие циклические соединения
Мета-гидроксибензоат
Пара-гидроксибензоат
Тестостерон
Алифатические аминокислоты
L-Валин
L-Аргинин +
Аминокислоты, имеющие кольцевую структуру
Гистидин
L-Триптофан*
Антраннлат*
Амины
Бензиламин*
Углерод и пр водные сахар
Триптаминамиламин
Различные соединения
Бетаин
Манноза* Добавочное соединение.
Таблица3
Показатели
11803 11854 11803 11854 11803 11854
Температура инкубации, С 30
30
30
Рост при, С
Глюкоза
Коричневый дийфундируюнЖй
0NPG 5 С +
Пигмент в культуральном бульоне
Apr. М11ег -ЗС +
Ъетаин CSU — 37 С
Лиз. М11ег
Глюкоза CSU
Орн. М11ег
И01 до 000 — Рост при рН 3-5 3+
Лактат CSU
Пантотенат
Углеводы и производные сахара (продолжение)
Галактоза*
Лактоза*
Мальтоза*
Мелибиоза*
Пи о циа ни н
Флуоресценция
L-Apr С SU
1389683 12
Продолжение табл. 2
Вьщеленный NCIB
) Т
1389683
14 абл. 3
Продо
7,2 3+
-8 3+
+9 3+
3+
Ацетат CSU
ДНК-аза
20 С +7
Жел. столб.
Рост в
NaC1
Жел. чаш" ка +
Стрептомицин
+ 2% 3+ 3+
37 3+ 3+
Слаб. 47. 3+ 3+
Хлорафен
Казеин +
Тетрациклин
+ 57—
+++ Крахмал +
+++
Новобиоцин
Лецитин—
Полимиксин В
О/129
Леван
В трипроновом бульоне
Индол
Требования к факторам роста
Н g(TSI) (Глюко- (Глйко- + Ацетатная слаб. слаб. за CSU) за" CSU) + бумага +
Твин 80
Уреаза
Пепто- Пенто- VP. Молоко низи- низирова- ровано но
Выделе- Выделе- Арг но но Торили
Чувствительность
Пенициллин С
00 до N<
Остат НОЯ
Яичный
Липаза
Яйца
Коричневый диффундирующий пигмент
Таблица4
Концентрация, мМ, среды (2 ) 3
Компонент
23,4 (г!л) 24,3 (г/л) 24,5 (г/л) Глюкоза
12 (24 мМ N) 24
25
25
25
СаС1 - 2Н О
0,2
0,2
0,2
H pO3
Иа ИоО 2Н 0
10х10
Таблица5
qn, r(r ) гг r/r ") Вг, г(г ) П, r(I ) Источник азота
Опыт р макс (ч ) -t ч ч ч -1
0,39
0,60
0 53
0,275
0,09
Аммиак
0,38
0,52
0,60
0,084
0 35
Нитрат
А 2
0,12
0,49
0,59
0,68
0,36
Глньтамат
Аммиак
О, 13
0,51
0,08
0,03
В
0,11
0,21
0,41
0,07
Глют амат
*HO — не определено. (ИН,),80+
NaNO
Na глютамат
КН РО
Na HPO, ®SO, 7Н,О
FeSOg 7Н О
МпБО 7Н O
ZnSO< 7Н<О
Cu SO. . 5Н О
СоС1 6Н О
20z 10-3
20х10-3
20х10
10х10
10-3
10х10
20х10
20х10
20х 1О
10х10
10х10
10х10
10х10
20х10 3
20х10
20х10
10х10
10х10 З
10х10
1Ох10
l 389683
Та блица 6
Образец
Штамм
5p + ПФ"
А. В 12 NaCl + 0,1X СаС1 при 30 С и избыточном давлении 1 атм
NCIB Бульон 11,0 63,0
0,71
11854 Обработанный 9,5 29,3 ферментом
ИИИ Бульон 17,5 59,6
0,73
0 74
В-1459 Обработанный ферментом 19,0 188,0
0,74
В. В 1Х NaCl + 0,1Х СаС1 при 70 С и избыточном давлении 1 атм
NCEB Бульон 37,3
7,5
0,71
11954 Обработанный 17,0 ферментом
ЯКИ Бульон 35,8 50,7
5,5
0,73
0,74
В-1459 Обработанный 8,5 40,9 ферментом
0,77
С. В 15Х NaC1 + 1,5Х CaC1 q при 30 С и избыточном давлении 1 атм
14,5
0,58
330
Бульон
NCIB
0,56
101
11854
22,1
0,61
30,8
81,7
NRRL
1000
0,63
1000
В-1459
В 15Х NaCl + 1,5Х СаС1 при 70 С и избыточном давлении 1 атм
0,58
299
17,0
Бульон
NCIB
1000
0,56
11854
1000
1000
1000
0,61
NRRL
0,63
1000
В-1459
1000
5,8,6
17,5
188, О
19,0
В-1459
В. В
37,3
7,5
Бульон
NCIB
Обработанный ферментом
Бульон
Обработанный ферментом
Обработанный ферментом
Бульон
Обработанный ферментом
Бульон
Обработанный энзимом
1Х NaC1 + 0,1Х
Время фильтрования для 200 мл, с Сухой вес
l полим. /л
1, 2р**
СаС1 при 70 С под давлением 1 атм
20! 389683!
Продохпкенне табл.6
1 азец
ПФ*
11854
17,0
5,5
50,7
35,8
NRRL
40,9
8,5
В-1459 Обработанный энзимом
С. В 15X NaCl + 1,5Х СаС1 при 30 С под давлением 1 атм
NCIB
330
14,5
Бульон
101
22,1
11854
81,7
30,8
NRRL
В-1459
i1000
>1000
СаС1 при 70 С и давлении 1 атм
D. В
299
17i0
Бульон
NCIB
>1000
>1000
11854
NRRL
Бульон
В-1459
*Пф — префильтр для сепарации грубого материала
** Без предварительного фильтра, но раствор ранее пропускали через
5p + префильтр.
Обработанный энзимом
Бульон
Обработанный энзимом
Бульон
Обработанный энзимом
15X NaCl + 1,5Х
Обработанный энзимом
Обработанный энзимом
>1000
)1000
)1000
)1000
Сухой вес полим./л
1389683 в
0 а
1 38 9683
ФР 5Ð фема (r) Рие 3
Редактор M.Недолуженко
Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул, Проектная, Составитель 3:Фалунина
Техред М.Коданич Корректор А.Обручар
Заказ 1587/58 Тираж 520 Подписное
ВШФП1И Государственного комитета СССР но делам изобретений и открытий
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Ь гп
1
15 <> ь
m b
М 1
Ь
1 э
