Способ определения ангиотензина 11

 

Изобретение относится к медицине , а именно к иммунохимии, предназначено для анализа ангиотензина II в биологических жидкостях. Цель изобретения - повышение чувствительности и упрощение способа. Для этого проводят синтез конъюгата ангиотензина II с кроличьим сывороточным альбумином . По окончании реакции конъюгат диализуют против 0,15 М NaCl. Также проводят синтез конъюгата ангиотензина -Ц с гемоцианином, смешанным с полным адъювантом Фрейнда 1:1. Иммунизацию проводят подкожно, в/мышечно. Первые 3 инъекции кроликам вводят конъюгатантиотензина II с кроличьим сывороточным альбумином, последние 2 - конъюгат II с гемоцианином . Между инъекциями 2-х недельные перерывы. Отбор крови у кроликов через 7 дней после последней инъекщш. Затем проводят синтез антиотензина II, меченого пероксидазой из эфена, выявление ангиотензина II ведут по активности пероксидазы в иммунном комплексе. i (Л

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„„SU„„1396057 А 1 (g1) 4 С 01 N 33/48, 33/535

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ н двторСНОМУ свиДЕТИлЬСтВу

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

llO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3774048/28- 14 (22) 25.07.84 (46) I5.05.88. Бюл. N- 18 (71) Всесоюзный кардиологический научный центр АМН СССР (72) И.Ю. Сахаров, Г.А. Ермолин и В,П. Масенко .(53) 615.373 (088.8) (56) Morton J.J. et al. Hormones

in himan blood /Ed. Н. Antoniades/, Harvard Universiny Press Cambridge

Mussachusetts and London, 1976, р. 607. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНГИОТЕНЗИНА II (57) Изобретение относится к медицине, а именно к иммунохимии, пред назначено для анализа ангиотенэина

ТЕ. в биологических жидкостях. Цель изобретения — повышение чувствительности и упрощение способа. Для этого проводят синтез конъюгата ангиотензина II с кроличьим сывороточным аль. бумином. По окончании реакции конъюгат диализуют против 0,15 М NaC1

Также проводят синтез конъюгата ангио" тензина .II с гемоцианином, смешанным с полным адъювантом Фрейнда 1:1.

Иммунизацию проводят подкожно, в/мышечно. Первые 3 инъекции кроликам вводят конъюгат антиотензина II c кроличьим сывороточным альбумином, последние 2 — конъюгат II с гемоцианином. Между инъекциями 2-х недельные перерывы. Отбор крови у кроликов через 7 дней после последней инъекции. Затем проводят синтез антиотенэина II, меченого пероксидазой из хрена, выявление ангиотенэина II ведут по активности пероксидазы в иммунном комплексе.

1396057

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунохимии, и может быть использовано при анализе ангиотензина II в биологических жидкостях.

Целью изобретения является повышение чувствительности и упрощение способа.

На чертеже показана калибровочная кривая определения ангиотензи- 10 иа II.

П р и и е р. А. Синтез конъюгата ангиотензина II с кроличьим сынороточным альбумином.

4 мг ангиотензина IT. и 22,2 мг кроличьего сывороточного альбумина растворяют в 200 мкп воды. Затем приливают 200 мкл раствора 1-этил3(3-диэтиламинопропил)карбодиимида (0,4 мг/мл) и проводят реакцию при 20 комнатной температуре и течение

30 мин при постоянном перемешивании.

По окончании реакции конъюгат диализуют против 0,15 М:ЯаС1.

Б. Синтез конъюгата ангиотенэиыа

II с гемоцианином.

2,15 мг ангиотензина II и 15,6 мг гемоцианина растворяют н 250 мкл воды. Затем приливают 250 мкл раствора

1-этил-3(3-диэтиламинонропил)карбодиимида (0,47 мг/мл) и проводят реакцию при комнатной температуре н течение 30 мин при постоянном перемешивании. По окончании реакции конъюгат диализуют против 0,15 NaC1.

В. Схема иммунизации.

В качестве антигена используют конъюгат ангиотензина .П с кроличьим сынороточным альбумином и конъюгат ангиотензина II с гемоцианином, смешанным с полым адъюнантом Фрейнда

1!1 (об./об.). Иммунизацию проводят подкожно, внутримышечно в пятки задних лап кроликов (0,3 мл смеси на кролика). В первые три инъекции кроликам вводят конъюгат ангиотензина

II с кроличьим сынороточным альбумином, в последние две — конъюгат аь;— гиотензина II .с гемоцнанином. Между инъекциями двухнедельные перерывы. 50

Отбор крови у кроликов осуществляют через 7 дней после последней инъекции °

Г. Синтез ангиотензина II, меченного пероксидазой. 55

К 1,8 мг пероксидазы из хрена (R>=3,О), растворенной в 0,5 мл дистиллированной воды, приливают

100 мкл водного раствора На10д с концентрацией 21,4 мг/мл. Окисление пероксидазы проводят при комнатной температуре в течение 20 мин при постоянном перемешивании. Полученный раствор диализуют против I мМ ацетатного буфера рН 4,7 в течение ночи при 4 С.

К окисленной пероксидаэе добавляют

2 мг ангиотензина II, растворенного в 510 мкл 14 мМ карбонатного буфера, рН 9,6. Реакцию ковалентного связынания пептида с ферментом проводят при комнатной температуре в течение

5 ч при постоянном перемешивании.

По окончании реакции в реакционную смесь при 4 С добавляют 50 мкл раствора NaBH< с концентрацией

4 иг/мл.

По прошествии 2-х ч восстановленный конъюгат помещают на диализ против 1,5 л 0,01 M фосфатного буфера, рН 7,4 при 4 С в течение 20-24 ч.

Полученный конъюгат ангиотензина

II с пероксидазой хранят н 50 глицерина при -20 С, Д. Определение содержания ангио1 тензина II в исследуемом образце.

К 100 мкл человеческой сыворотки крови больных и здоровых доноров в пластиковой пробирке приливают

400 мкл с 0,05М фосфатного буфера, рН 7,4, содержащего 0,01 M ЭДТА, 1Х бычий сывороточный альбумин, 20

КУБ/мл "Гордокса", 100 мкл кроличьей антисыноротки, полученной против ангиотензина Т?, и 500 мкл конъюгата ангиотензина II с пероксидазой и инкубируют при 4 С в течение 16-20 ч, В результате серологической реакции образуется иммунный комплекс антиген-антитело, который осаждают добавлением 200 мкл бараньей антисыворотки протин IgG кролика в 6Х-ном растворе полиэтиленгликоля н течение

30 мин при 4 С. После отделения осадка от супернатанта центрифугированием при 3000 об/мин в течение

15 мин при 4 C и отмывки осадка

0,15 M раствором NaC1, содержащим

0,05 Тнина, проводят регистрацию ферментативной активности нерастворимого иммунного комплекса. Для этого в каждую пробирку добавляют по

1 мл субстратной смеси, содержащей

0,01 Н О, 1 мг/мл аммонийной соли

2, 2-азидо-ди- (3-3 THëá енэтиазолин) 57 определить концентрации ангиотенэина II меньше 2 мг/мл.

4,0

О,Б /.2 81 Х 10 Ю

Составитель И. Вашкаев

Техред М.Ходанич Корректор М. Максимишннец

Редактор M. Бандура

Заказ 2490/46 Тираж 847 Подписное

ВНИИЛИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 з 13960 сульфокислоты в 0,0 1М цитратного буфера, рН 4,0. Реакцию проводят при комнатной температуре в течение

90 мин и регистрируют изменение оптической плотности при 414 нм на спектрофотометре СФ-26.

Содержание ангиотензина II в ис-. следуемой сыворотке определяют из калибровочной кривой. 1>

Построение калибровочной кривой отличается тем, что в качестве исследуемого образца берут пробу с известным содержанием ангиотензина II и 100 мкл сыворотки, отдиализованной против 0,003М раствора ЭДТА, содержащего 0,15 М NaC1, в течение 48 ч при 4 С.

Полученные данные свидетельствуют о том, что предел детекции предлагае-20 мого способа значительно выше, чем у известного способа, что позволяет

Формула и э о б р е т е н и я

Способ определения ангиотензина

II, включающий конкурентное взаимо1 действие между исследуемой пробой, меченным тест-антигеном и специфической антисывороткой с последующим отделением иммунного комплекса и вы» явлением ангиотензина II no количест ву метки, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности, используют антисыворотКу, полученную путем последовательной иммунизации конъюгатом ангиотенэина

II с кроличьим сывороточным альбумином и конъюгатом ангиотенэина П с гемоцианином, и выявление ангиотензина II ведут по активности пероксидазы в иммунном комплексе.