Способ конструирования рекомбинантных векторов усr р 2,усr р 3 и усr р 4

 

Изобретение относится к генной инженерии и качается способа получения рекомбинантного многокопийного дрожжевого вектора. Цель изобретенияповышение стабильности рекомбинаятных векторов. Способ получения векторов YCR р 2-4 заключается в том, что sek- тор, который имеет стабшгазирукщую функцию, вводят в регулируемый промотор так,что имеется возможность с помощью этого промотора управлять регулирукщей функцией. 2 шт. 3 табл.

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

IlO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТЬЙ (д) 4 С 12 N 15/00

i)3

И!.(21) 3991833/28-13 (22) 03. 12.85, (31) P 3444495.5 (32) 04.12.84 (33) ПЕ (4б) 30.12,87. Бюл. В 48 (71) Верингер Ингельгейм Интернацио-, наль ГмбХ (DE) (72) Анджей Следзиевски и Эва Хлебович-Следзиевска (PL) . (53) 577.2/048(088.8) (56) .Stinchcomb Ь.Т. et al.(1982)

J. Nol. Biol. 158, р.157-179, Clarke and Carbon. J. (1980) Nature, %87, р. 504-509. (54) СПОСОВ КОНСТРУИРОВАНИЯ PEKGMBHHAHTHbK ВЕКТОРОВ VCRp%, YCRp 3 и

YCRp4 (57) Изобретение относится к генной инженерии и касается способа получения рекомбинантного многокопййного дрожжевого вектора. Цель изобретенияповыыение стабильности рекомбинантных . векторов, Способ получения векторов

YCR р 2-4 заключается в том, что вектор, который имеет стабилизирукицую функцию, вводят в регулируемый промотор так,что имеется возможность с помощью этого промотора управлять регулирукзцей функцией. 2 ил. 3 табл.

13642

Изобретение относится к генной инженерии и.касается спбсоба получения рекомбинантного многокопийного дрожжевого вектора. 5

Целью изобретения является повышение стабильности рекомбинантнык векторов.

Стабильность векторов YCR p2-4 обеспечивается за счет помещения 10

CEN3-последовательности перед промотором алкоголь-гидрогеназы II (ADH2) .

При этом трансформированные с помо-. щью ADH2-CEN3-плазмиды слияния дрожжи культивируются в присутствии глю- 15 козы, то ADH2-промотор дезактивируется (ADH2-AUS), а СЕИЗ митотически стабилизирует YCRp-плаэмиду (СЕЯЗ"АК). . При переводе источника углерода на.

- этанол ADH2-промотор реактивируется 20 и полностью блокируется экспрессией с помощью, региона CEN3, что обеспечивает возможность амплификации до желаемого числа копий, На фиг.1 схематически изображены карты сайтов рестрикции к генетические карты плазмид рВСЗТХи ADH2-BS и показано получение YCR р2-плазмиды, на фиг.2 — карта сайтов рестрикции и генетическая карта плазмиды IDB

207 и показано получение YCR рЗ- и

YCR р4-плазмид, Способ осуществляют следующим образом.

Пример 1. Плазмида РЙСЗТХ З5 содержит часть рВК 322 с геном устойчивости к ампицилину (ApR) ОК1 для селекции и стабильного роста в Е.coli.

Кроме того, плазмида содержит ген

trp I на Есо К I/Есо R I-Х фрагменте 40 (45 kb), который происходит из хромосомы дрожжей III. Этот ген позволяет осуществлять отбор нужных клонов на штамме дрожжей trpl . На том же са"

MoM DHK-фрагменте находится АКБХ- 45 фрагмент (автономно реплицирующаяся последовательность). АКБХ-фрагмент позволяет DHK реплицироваться в дрожжах. рВСЗТХ-плаэмида содержит к тому же и СЕИЗ-последовательность на . 50

2,0 kb Hind III Bam HI-фрагменте, который происходит от.хромосомы дрожжей III. Плазмиды, которые содержат CEN3-последовательность, митотически стабильны и в клетке имеется

1-2 копии.

Плаэмида AD H2BS — это PBR 322 с клонированным в ВашНХ сайте, 2,0 kb BamHI — Sau ЗА--фрагментом хро41 мосомной DHK дрожжей, который содержит ген ADH2. При этом в результате соединений концов BamHI u Sau ЗА ре; генерируются места рестрикции BamHI так что ген ADH2 из ADH2S-плаэмнды может вырезаться.

Из опубликованной ДНК-последоваI тельности для гена ADH2 и 5 фланкирующих регионов известно наиболее благоприятное место рестрикции в позиции +67 (причем +1 является А ATGкодона). Это место выреза EcoRV совместно с местом выреза BamHI было использовано в позиции -1027 "против течения", чтобы изолировать ADH2промотор со всеми его 5 фланкирующими регуляционными последовательностями.

5 мкг ADH2BS-плаэмидной ДНК полностью переваривают с помощью EcoRV (фиг. 1)., очищают с помощью экстракции фенолом и осаждают этанолом, связывают "тупым концом" с 2 мкг фосфолированных BglII-звеньев (5 CAGATCTG3) (биологическая лаборатория) и вновь разрезают с помощью

BAm НХ и В@1ХХ; после препаративного арагоза-гель-электрофореза изолируют 1300 Ь р-фрагмент. Этот фрагмент содержит полный А13Н2-промотор со всеми регуляционными последовательностями и небольшой участок кодирующего ЛОН2 региона, 5 MKr рВСЗТХ-плазмндной ДНК полностью переваривают с помощью BamHIэндонуклеазы, очищают с помощью экс.тракции фенола и осаждения этанола и с помощью телячьей кишечной фосфатозы.

После новой экстракции фенолом и осаждения этанолом 100 нг BamHI разрезают и дефосфолированной рВСЗТХплазмидной ДНК соединяют с 200 нг

1,3 кЬ"фрагмента BamHI/BglII, ADH2промотора, Т ДНК-лигаэой. После этого компетентйые RRI-клетки трансформируют с помощью 1/5 этой смеси. Резистентные к ампицилину колонии отбирают путем гибридизации колоний благодаря тому, что маркированный радио" активно с помощью ник-трасляции

1,3 кЬ BamHI/BglII ADH2-промоторный фрагмент был использован в качестве пробы. Иэ 12 проявивших себя положительно колоний получают плаэмидную

ДНК и перерабатывают различными рестрикционными эндонуклеазами, чтобы идентифицировать клоны, которые имеют АВН2"вставку с ориентацией, котоз 1 36 рая дает возможность транскрипцию

ADH2-промотора с помощью CEN 3-после" довательности. Этот клон изолируют.

С целью определения количества копий и стабильности плазмиды в дрожжах с помощью YCR Р2-плазмидной ДНК трансформируют в штамм дрожжей SHU

32(trp, lou", cw, а3 ). TRP-трансформанты были изолированы и прове--. рены на стабильность и количес гво копий.

Трансформацию дрожжей осуществляют в соответствии с известным способом со следующими модификациями.

200 мл клеток с концентрацией

2х10 клетка/мл очищают промыванием в 25 мл Н О путем центрифугирования.

Эти клеткй обрабатывают 10 мл раствора 1 М сорбитола, 25 мМ EDTA (рН 8) и

50 мИ дитиотрейтола в течение 1О мин при 30 С и затем промывают 10 мл 1 М сорбитола. После этого пеллетированные клетки ресуспендируют в 10 мл

SCE (fM сорбитол, О, М цнтрат натрия, рН 5,8, и 0,01 M EDTA) и обрабатывают при 30 C с помощью 1 мг цимо.лиза 5000 (фирма "Кирин брауэрай").

° 807.-ную сферопластификацию осуществляют путем добавки 100 мп суспензии к 0,9 мл 107.-ного раствора SDS; изме-. рения проводят при AbS 6oo с применением клеточного раствора перед добавкой фермента как OX-ное выравнивание/лизис в 107-ном растворе SDS привел к осаждению осадка AbS soo)

Затем клетки трехкратно промывают, 10 мл 1 М сорбитола, один раз 1. М сорбитола, 10 мИ СаС1 и 10 мИ трисНС1 (pH 7,4) и затем ресуспендируют в 1 мл того же раствора. Затем добавляют 5-15 мкг очищенной плазмидной

ДНК и осторожно смешивают со 100 мкл ресуспензированных клеток в течение

15 мин. При осторожном перемешивании в течение 15 мин добавляют 1 мл раствора, который содержал 207.(М/V) полиэтиленгликоля 4000 (Мсг ск), 10 мМ

СаС11 и 10 мМ трис-.НС1 (рН 7,5). Затем клетки центрифугируют и нкубируют в течение 20 мин при 30 С в 200икл .раствора SOS (1М сорбитола, 33,5Х ,(Ч/Ч) УЕРД-бульона и 6,5 мМ СаС1 ).

Затем 100 мкл этой суспензии .помеща- ют на чашку Петри, которая содержит

4241 4 пластины (ТОР или 1.ЕУ селекция), Процентную стабильность плазмид определяют путем деления количества в колониях, которые выращены селективно, на количество в колониях, кото30 рые выращены неселективно, и последующим .умножением на 100.

Определение количества копий плазмид осуществляют птуем анализа

35;

Соузерна. Всю ДНК SHU 32-(YCR р)трансформантов, которые выращены в селективной среде, перерабатывают с помощью Eco R I-рестриктированной эндонуклеазы и фракционируют путем агарозного-гель-электрофореза. После

40 переноса на нитроцеллюлозные фильтры

ДНК гибридиэуют маркированной радиоактивно ник-трансляцией YIp5-плаз мидой ДНК (YIp5 — это рВК 322, кото45 рый содержит ДЖАЗ-ген дрожжей). После экспонирования на рентгеновскую пленку наблюдают по меньшей мере две полосы. В .качестве другого контроля .служит ДНК-проба трансформированного с помощью УСр-плазмиды SHU 32; благо50 даря этому оказалось возможным непосредственное .сравнение количества копий УСр» и YCR р-центромерных плазмид.

Данные приведены в табл. 1.

20 мл "Bottom"Agar" (182 r сорбптола, 20 r глюкозы, 0,7 r YNB и 30 г "Difeo

Agar" на 1 л Н10), и 10 мл 50 С "TopAgar (тот же состав, что и "Bottomtl

Agar, однако дополнительно с добавлением 1 мл алеина (1,2 мг/мл), 1 мл урацина (2,4 мг/мл) и мл смеси без триптофана на 50 мл "Bottom-Agar"

fp (смесь без триптофана содержит следующие аминокислоты на 100 мл H O:

0,2 г аргинина; О, 1 r гистидина;

0,6 r изолейцина; 0,6 r лейцина;

0,4 r лизина; О,f метионина; 0,6 г фенилаланина и 0,5 г треонина, эта

Trp+-селекция дала 10 трансформантов дрожжей ка 1 мкг плазмидной ДНК.

Стабильность плазмид в дрожжах проверяют благодаря тому, что клетки после селективного или неселективно.го выращивания разбавлены водой и

1 плакированы на УРД-пластины (неселек.тивно). После 30 ч роста при 28 С эти пластины плакируют на YNB+CAA

1364241

Таблица 1

Источник углерода в среде

7, стабильности плазмиды ,Номер эксперимента

Количество копий**

1-2

SHU 32

SHU 3Z

З SHU Зг

4 SHU 32

Глюкоза

Этанол

807 рВСЗТ1 рвсзт1

1-2

Глюкоза

YCRpZ

Этанол

5-10

367

YCRpZ СКрг

5-10

Этанол Глюкоза***

957

5, SHU 32

Этанол - " Глюкоза**"

957

8-12

6 SHU 32

* 7 стабильности .плазмиды определяется по 25 генерациям на неселективном выращивании.

* Количество копий определялось по 12 генерациям на селективной среде.

*** Штамм культивировался (12 генераций) на селективной среде этанола, затем на 12 генерациях проверялся на селективной: среде глюкозы и инокулят этой культуры был взят для определения стабильности и количества копий.

" "" Штамм культивировался в. тех же условиях, что и в пункте **, однако для 50 генераций на этайоле.

Была подтверждена стабильность

YCR р2-плазмиды, после того как на различных источниках углерода были выращены трансформанты. Если их культивируют тОлькО ца среде глюкозы, стабильность плазмид перемещается в сферу других YÑð-плазмид (примерно 40

80%); количество копий было незначительным (1-2 копии на клетку . см. примеры 1 и 3 в табл, 1), Глюкоза дезактивирует АОН2-промотор (АОН2-АБЯ), а CEN Ç-последовательность может ра- 4S ботать нормально (CEN 3"AN).

Однако если YCR р2-трансформанты культивируют на содержащей этанол среде, то стабильность плазмнды резко снижается (примерно до 36X), одна- б0 ко количество копий возрастает (до

5-10 койий на клетку). УСр-плазмиды при одинаковых условиях прежде были стабильны и в наличии имелось незначительное количество копий (см. примеры 2 и 4 в табл. 1). Это показывает, как транскрипция вновь реактивироваиного ADH2-промотора (ADH2-AN) блокирует СЕЯ 3-последовательность (CHN

3-AUS). Как результат YCR2p-плазмида ведет теперь себя, как YRp-плазмида: очень нестабильна, однако с большим количеством копий.

Стабильность YCRp2-плазмида стала вышее, чем прежде, когда среда была вновь перемещена на глюкозу. Стабильность на этой среде составила почти

95Х а количество копий на клетку ос" талось постоянным: 5-10 копий (см. пример 5 в табл. 1). Таким образом, глюкоза вновь дезактивирует АПН2-промотор (ADH2"AUS) и реактивирует

СЕИЗ«функцию (СЕЯ 3-AN). Однако сами дрожжи во время культивирования на этаноле не могли больше аккумулиро- . вать YCRp2-плазмиду. Даже после 50 генераций на среде этанола YNB+CAA ко» личество копий не превышало 8-12 копий на клетку (см. пример 6 в табл. 1).

П р и и е р 2. Получение YCR рзи YCR p4-плаэмид схематически пред; ставлено на фнг. 2. Вектор р?ПВ207 содержит бактериальную рАТ153-плазмиду (34) с резистентнымн генами амлицилина (ApR) и тетрациклина (Tet" ) и

136424

0RI для селекции и стабильного роста в E.coli. Кроме того, плазмида содержит 2,7 кЬ вЂ” EcoRI/EcoRI фрагмент

2р-ДНК. На этом фрагменте локализова- 5 но как 2 р место репликации, что дает возможность вектору экстрахромосомно реплицироваться и проявляться, так и REP3-локус 2р-ДНК. Этот локус является важным элементом 2 системы ам- 10 плификации и должен занимать цис-положение, чтобы сделать плазмиду способной к амплификации. Селекционный маркер LEU 2, из которого происходит дрожжевая хромосома III, был клавира- 15 ван после нескольких модификаций s

PSt 1 места разреза упомянутого 2 р

ДНК фрагмента. Этот ген LEU2-d дает возможность осуществлять селекционирование íà Leu2 -дрожжевых мутантах и дополняет мутацию Leu2 только тогда, когда она существует в "многокопийном векторе".

Для получения YCR p3- и YCR р4- 25 плазмид перерабатывают 5 мкг YCR р2-ДНК с Bgl II- u Bam HI-рестрикционной эндонуклеазой. После препаративного электрафореза в арагозном геле изолируют фрагмент Bgl II/Bam Зп

HI размером 4,2 кЬ. Этот фрагмент содержал TRPI-ген дрожжей и А0Н2-CEN

3-слияние. 5 мкг pIDB207 плазмидного

ДНК перерабатывают с Bam HI и очищают путем экстракции фенолом и осажде- 35 ния этанолом и дефосфорилируют с помощью телячьей кишечной.фосфатазы.

100. нг полученной таким образом

pIDB207-плазмидной ДНК лигируют с по-. мощью 200 нг 4,2 кЬ вЂ” Bgl II/Âàm HI 4О

YCR р2-фрагмента. Е .cali RR I клетки трансформируют с помощью i/5 этой смеси и изолируют колонии ApR. Bce без исключения колонии проверяют путем их. гибридизации с применением 4> пик-транслированного 4,2-кЪ-фраг-. мента YCR р2 в качестве пробы. Иэ . проявивших себя положительно колоний изолируют плазмидную ДНК и составля« ют карту сайтов рестрикции этих плазмид. Так как Bgl II/Âàø HI-фрагмент. .клонируют в двух различных ориентациях в Bam HI-местах разреза рХВВ207, 1

8 возникает две плазмиды: YCR р3 и

YCR р4 (фиг. 2) .

Ориентирование кловираввввага влияния ADH2-CEN 3-слияния не оказывает никакого влияния на стабильпасть и количество копий YCR p-плазмиди в дрожжах. YCR p3-плазмида теперь со- держит два маркирующих гена дрожжей:

LEU 2-1 и TRPI-ген, дополняют одну

-t

trpI -мутацию в самих драя;жах тогда, когда он содержится только в одной копии на клетку, LEU 2-d-ген дополняет 1еи 2 -мутацию только тогда, когда он находится на "многокопийной плаэмиде" (50-100 копий на клетку).

Эта система дает возможность осуществлять проверку количества копий путем простого плакиравания на селективной среде. Все LEU+ клетки должны содержать по меньшей мере 50 плазмидных копий на клетку, в то время как

TRP -клетки содержат по меньшей мере одну копию плазмиды. Кроме того, существует SHU 32-штаммы cir, т.е. он имеет "дикий тип" 2 ДНК, что обеспечивает YCRp3-вектор двумя другими компонентами системы амплификации 2 : REPi и REP2. Полностью активная система амплификации 2р требует REP1 и REP2 в транс и REPÇ и

ОК1 в цис.

Дрожжевой штамм ЯНБ 32 (cir

trpI, 1ец 2 ur a3 ) трансформируют с помощью УСКрЗ-плазмидной ДНК, TRP -трансформанты изолируют и проверяют на Leu u ura . Все трансформанты, которые были проверены, являлись Leu .и . ura и показали, что

УСКрЗ-плазмида существует в не начительном количестве копий. Этот результат не был неожиданным, так как в качестве источника углерода использовалась только глюкоза, т.е. CEN 3 должен был быть полностью функционально способным. CEN 3-функция преодолевает систему амплификации и стабилизирует количества копий плазмид в пределах 1-2 копии на клетку (пример 2 в табл. 2) . Стабильность YCR р3 в дрожжевом штамме SHU 32 при выращивании на глюкозе также характерна для УСр-плазмиды (аколо BOX).

1364241

Таблица2 Номер

Ф

Источник углерода в среде

Штамм Плазмида во копий* плазмиды* эксперимента

TRP

LEU+

100

727

Глюкоза

857., 1-2

Ие увеличивалась

Глюкоза

2 SHU 32 YCRp3

657

857 Не определено

3 SHU 32 YCRp3

Этанол

Этанол - Глюкоза 987

4 SHU 32 YCRp3

997 !00

Однако если трансформированный с 2p, помощью YCR р3 штамм SHU 32 культивировался на селективной — leu — этанол-среде, то стабильность плазмиц снижалась, когда было измерено количество leu+ колоний, примерно íà 65Ж.

Предполагается, что CEN 3-последовательность в присутствии этанола транскрибируется реактивированным АЭН2.промотором. С помощью селекции иа

LEU+ и нефункционального центромера 30 система амплификации 2 берет на себя контроль и амплифицирует YCR р3 в большое количество копий. SHU 32трансформанты стали LEU+, а стабильность YCR р3-плазмид является при этих условиях характерной для 2,и химерной плазмиды (см. примеры 1 и 4 в табл. 2). Эти ожидания нашли подтверждение, после того, как SHU

32-трансформанты затем культивирова- 4р лись на этаноле и глюкозе, и было определено количество копий плаэмид.

Количество копий YCR p3 достигает примерно 10& на клетку. Кроме того,> плаэмида была очень стабильна (более 90Ж)„ что можно под вердить с помощью количества leu+ колоний.

В табл. 3 представлены данные о стабильности YCR p4-плазмид. т

Продолжение табл. 3

Ж с та биль нос ти плазмиды

Колич ес тво копий

ФФ

Ис точник углерода в среде

UE0+ ТЯР

887 Не определено

Этанол 70Ж

Таблица 3

Ж стабильности Количестплазмиды * во, копий**

Источник углерода в среде

LEU+ TRPB

Глюкоз а 75

1 SHU 32 pIDB207

7. стабильности КоличестЭтанол - Глюкоза***

987. 997 100

Примечания к табл, 2 и 3 те же, что и для табл. 1.

Получение плазмид с регулируемыми центромером функциями, как показано для YCR р-плазмид, имеет большую пользу для размножения как гетерологических ДНК, так и для выражения гетерологических белков и дрожжах.

Если например, в полученный в соответствии с изобретением многокопийный дрожжевой вектор соответствующим образом вводится гетерологическая

ДНК, то она путем смены воздействующих на регулируемый промотор факторов (например, в случае ADH2-промотора . замены источника углерода), будет размножаться с помощью вектора до желаемой концентрации.

Еще большую пользу приносят полученные в соответствии с изобретением векторы, если гетерологическая ДНК с помощью системы выржения для экспрессии гетерологических белков встраивается в векторы в правильной ориентации.

Эффективность процесса ферментации зависит от вида белка. Если, на1

424 !!

30

38

0

36 пример, экспресскруется белок, который, начиная с определенной концентрации, является токсичным для организма, то весь процесс ферментации может стать неэффективным, если количеством белков нельзя управлять непосредственно или косвенно.

С помощью полученных в соответс твии с изобретением векторов можно только путем смены воздействующих на регулируемый промотор факторов, например, путем смены источника углерода, количество копий экспрессионных плазмид устанавливать на низкое, среднее или высокое значение и на соответствующем уровне стабилизировать.

C помощью этих векторов даже можно получкть токсичный для организма продукт благодаря тому, что количество 2 копий векторов выражения в основании фермечтации нескольких генераций мало к отдельные плазмкды поддерживают стабильными. Если затеи образовано достаточно клеточного материала, промотор "переключается", например, путем сиены источника углерода, и количестно копий в экспрессионных плазмидах резко увеличивается. Тем самым одновременно производится желательный белок в большой концентрации; токсичность белка к этому моменту времени маловажна.

Полученные в соответствии с изобретением векторы дают возможность выбирать неселективные условия культивирования; значительное преимущество прежде всего с точки зрения использо" вания для получения белков на генотехнологическом пути.

28 декабря 1984 г в "Немецкую коллекцию микроорганизмов (DSN)", Гризе.бахштрассе, 8, Д-3400 Геттинген были сданы на хранение: а

Е.coli штамм RRI (обозначение RRI) под номером DSN3176;

Saccharomyces cerevisiae штамм

SHU 32 (обозначение. SHU 32} под номе. ром DSN 3182; 5 плазмида: рВСЗТ1, трансформированная в Е.coli RRI (обозначение рВСЗТ1) под номером DSN 3180; плазмида: рАП Н2Б, трансформированная в E.coli RRI (обозначенная

pAD H2B) под номером 0ЯИ 3179 и плазмида: рЮ В207, трансформированная в Е.coli ККЕ(обозначенная рП)

В207) под номером DSN 3181.

Все пробы ДНК были обрезаны с поМощью ЕсоК! и гкбридиэированы YIp5 плазмидной ник-трансляционной ДНК.

1) 3 мкг всей 11НК штамма ВНБ 32 (pEB 108) — типичная УСр плазмида;

2) 3 мкг всей ДНК штамма ЯНШ 32 (YCRp2) — глюкоза;

3) 3 мкг всей jlHK штамма SHU 32 (YCRp2) — этанол глюкоза;

4) 3 мкг всей ДНК штамма SHU 32 (YCRp2) — этанол (50 генераций)глюкоза;

5) 1 мкг всей ДНК штаммa SHU 32 (pIDB207);

6) 0,2 мкг всей ДНК штамма SHU 32 (рШВ207);

7) 0,05 мкг всей ДНК штамма SHU 32 (рП)В207};

8) 5 мкг всей ДНК штамма SHU 32 (YCRp3) — глюкоза;

9) 1 икг всей ДНК шт". з;я SHU (YCRp3) — этанол - глюкоза;

1О) 0,05 мкг всей ДНК и тамма

SHU 32 (УСКр3) — svaIEoal — глюкоза;

11) 0,05 мкг всей ДНК штамма SHU 32 (УСКрЗ).- этанол — глюкоза. формула изобретения

Способ конструирования рекомбинантных векторов 7СКр2, УСКр3 и

УСКр4, заключающийся в том, что нлазмиду рВСЗТ1 расщепляют рестрикционной эндонуклеазсй ВашИЕ с последующей очисткой и дефосфорилкрованием полученной линейной ДНК, плазмиду АЭН2ВБ расщепляют рестрикционной эндонуклеазой EcoRV с последующей очисткой полученной линейной

ДНК и ее связыванием с фосфолированным линкеро!м Вя1II к полученный при этом фрагмент расцепляют рестрикционной эндонуклеазой ВашНЕ и В@111 с последующей очисткой фрагмента размером 1,3 кЬ, полученные фрагменты

cBHssIB T Ty ДН1 .-JIHAD aaой с o iченк" ем вектора YCRp2, который расцепляют рестрикционнок эндонуклеазой ВашНЕ, и

Б@1ЕЕ с последующим выделенкем и очисткой фрагмента 4,2 кЬ, а плаэми- . ду pIDB207 расщепляют рестрикционной эндонуклеазой BarnHI с последую;щей очисткой и дефосфорклкрсванкем полученной при этом линейной ДНК и полученные фрагменты связывают с.

ДНК-лигазой с получением векторов

YCRp3 и YCRp4.

136424)

Есоя нкап

mHIIBglll

BamHI

1364241

Ес

KcoRI Hind ill вН!

% с!Я

ieaal

Есой!

ЕсоЯ!

ЕсоЯ

Есой!

Есой

Составитель Н. кузенкова

Редактор А. Лежнина Техред Л.Серд!окова Корректор В .Бутяга

Заказ 6387/58 . Тираж 500 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Уагород, ул. Проектная, 4