Способ получения клона бактерий еsснеriснiа coli, трансформированного плазмидой pbr322,содержащей вставку рsт- 1,кодирующую интерферон @ или @

 

Изобретение относится к области биотехнологии и генной инженерии . Целью изобретения является одновременный отбор клонов, несущих рекомбинантные молекулы ДНК с геном, ксдируюпщм ei- и 0-интерферон. Одновременный отбор клонов обеспечивается наличием гомологии между (от 5 до 7) функциональными IFN-Ыи генами. Участок гомологии имеет длину 13 нуклеотидов со следующей формулой 5 CCTTCTGGAACTG-3 . Кроме того , и РНК из клеток Namalva выделяют через 9 ч после индукции вирусом, синтез к ДНК осугчествляют на (Л) РНК с величиной молекулы 6 и 18 S, а дн.ДНК получают размером 600 п.о. иэ ы

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН (19) (11) 151) 4 C 12 N 15/00

РУГ:». AMP;. % Я

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н IlATEHTV

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 35984?9/?8-13 (22) 27.05.83 (31) P 3220116.8 (32) 28.05.82 (33) DI" (46) 15.10.87. Бюл. У 38 (71) Др. Карл Томэ ГмбХ (DE) (72) Эва Дворкин Растл (АТ), МаркБрус Дворкин (UB), Гюнтер Адольф, Петер Мейндл, Герхард Бодо и Петер

Светлый (АТ) (53) 575.224.2.577.2(088.8) (56) Nature, 284, 316-320, 1980, Nature, ?85, 542-547, 1980. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КЛОНА БАКТЕРИИ

EHCHERICHIA C0LI, ТРАНС ОРМИРОВАННОГО ПЛАБМИДОИ рВН322, СОДЕРЖАУ!ЕЙ

ВСТАВКУ Pat-1, КОДИРУЯ(11УЮ ИНТЕРФЕРОН ИЛИ (57) Изобретение относится к области биотехнологии и генной инженерии. Целью изобретения является одновременный отбор клонов, несущих рекомбинантные молекулы ДНК с геном, кодирующим - и 8 -интерферон, Одновременный отбор клонов обеспечивается наличием гомологии между (от 5 до ?) функциональными IFN-Ыи IFN-P генами. Участок гомологии имеет длину 13 нуклеотидов со следующей формулой 5 CCTTCTGGAACTG-3 . Кроме того, и PHK из клеток Narnalva выделяют через 9 ч после индукции вирусом, синтез к ДНК осуществляют на (A)+

PHK с величиной молекулы 6 и 18 8, а дн.ДНК получают размером 600 п.о.

1346048

Изобретение относится к области биотехнологии и генной инженерии.

Целью изобретения является одновременный отбор клонов, несущих рекомбинатные молекулы ДНК с геном, кодирующим — ир -интерферон.

Одновременный отбор клонов обес-" печивается наличием гомологии между (от 5 до 7) функциональными IFN-gu IFN-p-генами. При этом участок гомологии имеет длину 13 нуклеотидов со следующей формулой 5 CCTTCTGGAA1

CTG3 ° Кроме того, и РНК из клеток

Иаша1ча выделяют через 9 ч после индукции вирусом, синтез к ДНК осуществляют на (А)+ PHK с величиной молекулы 6 и 18 $, а дн.ДНК получают размером 600 п.о.

Пример 1. Выбирают подходящие клетки для производства поли(А)

РНК, которые содержат человеческие

IFN- g u IFN-I3- ИРНК..

Различные человеческие клетки индуцирувт сендайвирусом для производства интерферона известными методами. Через 24-48 ч определяют содержание IF¹a и IFN- нейтрализацией специфической для типов антисывороткой..

Выявляют, что клетки намальва продуцирувт более 50% IFN-а и до

50% IFN-P после индукции сендаивирусом.

Тест на нейтрализацию проводят следующим образом.

Приблизительно 10 ед„ интерферона о инкубирувт при 37 С в течение 6080 мин:

1) антисыворотка против IFN- ; окончательное разбавление 1:!00;

2) антисыворотка против человеческого IF_#_- ; конечное разбавление

1:300;

3) смесь первой и второй антисывороток.

После инкубации определяют остаточную активность интерферона методом определения стерильных пятен, +

Пример 2. Получают поли(А)

PHK которая содержит человеческие

IFN-g- ..иРНК из клеток намальва, индуцированных сендаивирусом.

Разводят клетки намальва и индуцируют сендаивирусом. иРНК выделяют через 9 ч после индукции сендаивирусом, так как после этого интервала количество интерферонспецифических мРНК достигает максимума.

1Б

21ЭО

3!i

Клетки отделяют центрифугированием и течение ?О мин при 1000 g один раз промывают GyAepoM 11Р-40 (0,14моль

NaC1, 1,5 ммоль МяС1,„ 10 ммоль трисНС1, рН 7,4) и ресуспендирувт в NP

40 (Shell)-буфере с 0,-57. неионного детергента iP-40 (Шелл) и 2 мг/моль бентонита. Через 5 мин в ледяной бане клеточное ядро центрифугируют, пеллетирувт, как описано вьппе, экстрагирувт содержащую PHK цитоплазмическув фракцию добавлением ?7. натрийдодецилсульфата, 5 ммоль этилендинитрилотетрауксусной кислоты и

50 ммоль трис-HCl рН 9, затем трижды смесью фенол — хлороформ и оцин раз хлороформом и непосредственно после этого осаждают РНК спиртом.

Поли(А) РНК очищают с помощью олиго(ЙТ)-целлюлозной хроматографии, в результате центрифугирования в 520%-ном градиенте сахарозы в 10ммоль буфера ацетата натрия, рН 5,5, 1 ммоль этилендинитрилотетрауксусной кислоты(20 ч при скорости 25000 об/мин с ротором Spinco 811 27) разделяют по величине молекулы и собирают молекулы величиной порядка 6 S (единица

/ седиментации и 18 S для простоты названная поли 12S-PHK), Содержание интерферонспецифической иРНК (ХИ1- g u IFN-p мРНК) определяют в результате микроинъекции

128-РНК в ооциты херононуса, измеряют активность интерферона в ооцитах, При этом получавт 1 г инъецированной (12S-PHK среднего титра интерферона около 1000 IE интернациональная единица интерферона, считая на стандарт интерферона 69/19, При этом около 807 активности нейтрализуется антисывороткой против

М-типа интерферона, в то время как общая активность нейтрализуется только смесьв, состоящей из анти-М- и анти- -интерферона антисыворотки.

Пример 3. Поли(А)+ РНК, которая имеет величину молекулы 6-18 S (12S-PHK), применяют в качестве матрицы для получения однониточной кДНК, причем 40 г/мл поли(А) РНК инкубируют в 50 ммоль трис-НС1, рН 8,3, 10 ммоль МяС1, 100 моль KCl 1 ммоль

dIITPS, 0,4 ммоль дитиотрейтола, 4 ммоль пирофосфата натрия, 20р г/мл олиго(деокси7тимидина 12-18 (РГ-биохимия), 25 г/мл BKTHHOMHDHHR D co

100 ед/мл АМУ обратной транскрипта1346048 зы в течение 45 мин при 44-45 С, Непосредственно после этого РНК гибри. да PHK-ДНК удаляют путем одночасовой инкубации в 0,3 моль NaOH npu

50 С, после чего однониточную кДНК нейтрализуют и осаждают этанолом, Вторая нитка ДНК, комплементарная к однониточной ДНК, синтезируется прн следующих условиях: 30 р г/мл оцнониточной кДНК инкубируют в

0,12 моль буфера АосАата калия, рН

6,9, 10 ммоль MgC1, 10 ммоль дитиотрейтола, 1 ммоль 6ИТРЯ с 300 ед/мл

ДНК полимеразы 1 (Bolhringer MannheIm), 6 ч 15 С. Затем экстрагируют фе:-олом и осаждают этанолом.

Полученную таким образом двуниточнус. CMech кДНК у обоих концов нитки модифицируют, удаляют выступающие ко;-цы отдельных нитей. Для этого ДНК инкуоируют в 0,3 моль NaCl, 30 ммоль ацетата натрия, рН 4,5, 1 ммоль

KnClq с 1250 ед/мл S 1 нуклеазы (Miles Laboratories) в течение

30 мин при 37 С, после чего экстрагирунт фенолом и осаждают этанолом.

Полученную таким образом двуниточную кДНК разделяют на 5-20Х-ном градиенте сахарозы в 10 ммоль буАера ацетата натрия при рН 5,5, в ммоль этилендинитрилотетрауксусной кислоты и выделяют те Аракции, которые имеют по крайней мере 600 о,п. кДНК (0,5 II г)

I удлиняют приблизительно на 15 нуклеотидов путем наложения олигодезоксиl цитидина у 3 -конца обеих в результате инкубации в 140 ммоль калийкакозилата, рН 6,9, 30 ммоль трис-НС1, рН 6,9, 2 ммоль СоС1, 0,1 ммоль дитиотрейтола, 0,! мг/мл BSA, 5 р моль

ЙСТРз с помощью 500 ед. терминальной трансферазы в течение 4 мин при 3? С.

Аликвоту 2 tI r рВБ322 линеаризуют с помощью. рестрикционной эндокуклеазы

Pst 1, смесь кДНК удлиняют путем наложения олигодезоксигуанидина у конца 3 молекулы и модифицируют, полу-. чая выступающие концы олигодезоксигуанидина, Получают стабильные днДНК путем основного спаривания концов олигодеоксигуанидина со свободными концами олигодеэоксицитидина молекулы кДНК. Для этого оба компонента этой реакции инкубируют в 0,1 ммоль NaC1, 1 ммоль этилендинитрилотетрауксусной кислоты, 20 ммоль тряс-HCl, рН 8, в о течение 10 мин при 65 С, затем в тео чение 2 5 ч при 45 С и затем в течение ночи при 37 С.

С помощью этого метода регенерируется место расщепления рестрикционной эндонуклеазой Рз1 1 и в последствии это можно испольэовать для тогo чтобы вырезать из векторного гибрида кДНК-вставку.

Полученные этим методом гибридплазмиды из гВН322 и намальва-кДНК применяют для трансформации Escherihia сoli HB 101, Этим методом получают 30000 клонов трансформированных клето, E. coli, которые разделяют на микротитропластинах.

Пример 3. Тридекануклеотид метят в 50 ммоль трис-НС1, рН 7,5, 10 ммоль М1 С-!, - ммоль дитиотр IITO

JIR> Ь,.l ммоль спермидина, 1 р м Р\ 1 з -гд нозинтрифосАата с 60 ед./мл Т4 полинуклеотидкиназы (Bethesda Beseагс11 Laboratories) в течение о

30 мин при 37 С до специфической активности около 500 Кп/ммоль у

5 -конца молекулы.

26 Этот меченый тридекануклеотид прчменяют в качестве праймера (Dsi, mes) для синтеза однониточной кДНК, при этом в качестве матрицы служит поли А) ДНК из кндуцированных сендаи+-, виру"ом клеток намальва, Реакцию проводят при 5-10-кратном мопярном избытке праймера по отнонению к РНК в

50 ммоль трис-HCl, pH 8,3, 60 ммоль

КС1 5 ммоль дитиотрейтола, 50 р г/мл актиномицина 1, 4 ммоль МяС1

4 ммоль натрийпирофосАата, 0,5 ммоль

dNTPS со 100 ед./мл ЛМУ обратной транскриптазы в течение 90 мин при

37 С. После удаления PHK гибрид PHI<ДНК инкубируют 1 ч в 0,3 моль NaOH

40 о при 50 С с поспедующей нейтрализацией 0,3 моль уксусной кислоты и кДНК применяют в качестве пробы гибридизации. Полученная таким образом кДНК несет радиоактивную метку линь в молекулах, которые были синтезиро: ваны из интерАеронспецифического тридекануклеотида в качестве праймера и, следовательно, обладает высокой специАичностью для опознания интерБО АеронДНК-последовательности в гибридизации.

Пример 4. Клетки отдельных клонированных трансАормантов переводят на нитроцеллюлозный Аильтр (22II15 см, величина пор 0,45 рм, Milligore odes Schlliches), выращивают до величины колонии 2 мм диаметром и подготавливают к гибриди1346048 зации. Гибридизацию нуклеиновой кислоты меченой на концах кДНК проводят в смеси, содержащей 50 формамида, 4хБЕТ (IXSFT=0,15 моль NaC1, 5 ммоль этилендинитрилотетрауксусной кислоты, 50 ммоль трис-НС1, рН

8), 1храствора Денхардта (0,02 ВБА, 0,02Х фиколла, 0,02 поливинилпирролидона), 0,5 мг/мл денатурированной спермы лосося ДНК, 0,1Х натрийпиро фосфата и О,IХ натрийдодецилсульфата, в течение 48 ч при 37 С. Фильтр промывают в растворе, состоящем из

50 формамида и 0,2хББС (lх SSC=

=0,15 моль NaC1, 0,015 моль нитрата натрия) при 20-25 С в течение 6-8 ч и затем опрыскивают раствором 1кББС.

Фильтры высушивают при 20-250С и при -70 С экспонируют с рентгеновской пленкой (кодак XR). Всего в результате скрининга получают приблизительно 13000 трансформированных колоний бактерий и выделяют 190 клонов.

B соответствии с этим около 1Х всех 25 клонов клонбанка содержат специфическую последовательность dCCTTCTGGAACTG.

Пример 5. Тридекануклеотидпозитивные клоны (микротитропластины

Pl и Р2) и произвольно выбранные клоны микротитровой пластины (E52) переносят на нитроцеллюлозный фильтр, разводят, подготавливают для гибридизации бактерий и гибридизуют раз т личными Р-меченными кДНК-вставками.

Гибридиэацив проводят, добавляя в . раствор гибридизации 50 ш г/мл поли(11) и 10 ц г/мл поли (Х): поли(С), фильтр промывают после гибридизации в 50Х-ном формамиде и lх SSC. Оказа40 лось, что клон Р1Н! гибридизирует более чем 90% всех тридекануклеотидпозитивных клонов пластины Pl и Р2, а также некоторые клоны пластины ES2.

Идентичность многих этих клонированных последовательностей подтверждают рестрикционным анализом. Клон Р2Н10 гибридизируется не только сам с собой, а также с клоном позиции 1С12, IF!2, Е52Е1. Кпоны PlA6 и Р2310 анализируют таким же методом.

Пример 6. Поли(А)+ РНК отделяют от индуцированных и неиндуцированных клеток намальва, денатурируют s результате инкубации в течение 1 ч при 50 С в 1 моль глиоксаля, 50 .-ном диметилсульфоксиде, 10 ммоль буфера фосфата натрия, рН 7, разделяют на

1,4 -ном плавающем агаре, переносят на нитроцеллюлозный фильтр и гибридизируют с плазмидной ДНК, Р-меченной с помощьв никтрансляции. Плазмидную ДНК, которая произошла от индуцированного гена, гибридизируют в этой серии опытов только PHK из индуцированных клеток, но не РНК иэ неиндуцированных клеток. Применяемые для гибридизации плазмиды-ДНК являются PIHI (А), PIFI2 (В,I), Р2Н10(С), PlA6 (Е), Р2ВIО (Г). Из испытанных плазмид гибридизировались только

PlF12, Р2НIО и РIА6 только с PHK из индуцированных клеток, в то время как

P1Hl и Р2ВIО гибридизуются также с

PHK из неиндуцированных клеток. Beличина молекулы РНК, гибридизирующейся с PIF12 и P2HIO, 11-12 S, величина РНК, гибридизирующейся с Р!АН, 12-14 Б (эти величины молекул известны для IFN- g или IFN- -иРНК. Плазми,цы PIF12, Р2Н10 и PIA6 исследуют ,цополнительно, чтобы однозначно установить их содержание в интерферонДНКпоследовательности.

Пример 7, Плазмидную ДНК фиксируют на нитроцеллюлозном фильтре и инкубируют при условиях гибридизации с поли(А) РНК из индуцированных клеток намальва. Получают связанную

ДНК-последовательность интерферона.

Негибридизированнув РНК смывают, гибридизированную PHK выплавляют из ДНК и инъецируют в ооциты Хепориз 1aevis.

Если в ооцитах синтезируется интерферон-протеин, антивирусные свойства которого могут быть доказаны методом подсчета стерильных бляшек, 10 р г линеаризованной плазмидной ДНК денатурируют в 200 шл 0,5 í. NaOH, нейтрализуют 200 ил 0,5 н. уксусной кислоты и 20 х БЕТ и фильтруют связыванием на нитроцеллюлозном фильтре диаметром 2,5 мм. Фильтр высушивавт при комнатнои температуре, выдерживают 2 ч при 80 С и затем в течение

1 ч при 53 С или также при 37 С в смеси, содержащей 50Х формамида, 20 ммоль пиперазин-И,N -бис-(2-этансульфокислоты), рН 6,5, 0,4 моль

NaCl, 5 ммоль этилендинитрилотетрауксусной кислоты, 10 декстрансульфата, l . натрийдодецилсульфата,20 4г/мл

F.. coli ntPHK, 50 pr/мл поли(А)прегибридизированной, и в самом буфере после добавления 14-40 р г индуцированной намальва-поли(А) РНК гибриди1346048

40

P1F13 50

Р2НI О 50

45

Р1HI <2

Р2В10 <2

Пример 7. Исследуют вставки кДНК клона P!F!2 и Р2Н!0 с помощью рестрикционной эндонуклеазы, причем определяют наличие сайтов рестрикции эндонуклеаз BhmHI, BgI II, Есо RI

Hind III, EstI и Pvu II. Сравнивают рестрикционные карты PIE!2 и Р2Н10 с известным из литературы геном для

IFN-P. Все три клона имеют Pvu II, зировали в течение 5 ч. После этого фильтр промывают Зх20 мин при 25 С в смеси, содержащей 0,2-1 SET, 0,2Х натрийдодецилсульфата IХ декстран0

5 сульфата, 5 Iiir/мл т-PHK затем 2 х 10 мин при 25 С в смеси, содержащей

2 ммоль этилендинитрилотетрауксусной кислоты, рН 8,0, 0,2Х натрийдодецилсульфата, IХ декстрансульфата, 10

5 рг/мп т-РНК, затем 5 мин 60 С в смеси 2 ммоль этилендинитрилотетрауксусной кислоты, рН 8,0, 0,2Х натрийдодецилсульфата, IХ декстрансульфата, 5 liir/мл т-РНК, затем 5 мин при 60 С в 2 ммоль этилендинитрилотетрауксусной кислоты, рН 8,0, 0,2Х натрийдодецилсульфата, 5 ц г/мл т-РНК.

Гибридизированную РНК в течение

4 мин элюируют при 100 С в 1 мл Н О 20 с 10 рг т-PHK. После хроматографии на олиго-(йТ)-целлюлозной колонке

PHK осаждают этанолом, вносят в

5 мп Н<0 и инъецируют в ооциты Xenopus laevis. Ооциты после инкубации 25 в течение 2 дней при комнатной температуре испытывают методом подсчета стерильных бляшек на активность интерферона.

Подтвердилось, что клоны PIF!? и

Р2Н10 несут вставку интерферонДНК.

В таблице приведены результаты испытаний.

PstI u BgI IT сайты рестрикции. Кроме того, последовательность ДНК вставки клонов P!F!2 и Р2Н10 с ТР11геном определяют по методу Максама и Гилберта (правый 3 Pvu II — и

BgI II фрагмент) и сравнивают с опубликованной IFN-P †последовательностью. Последовательности P!F!2 и

Р2НIО идентичны с IFN-P-геном.

Выяснилось, оба клона на 5 конце не имеют полной IFN- ."-последовательности, у них отсутствуют приблизительно 60 куклеотидов региона, кодирующего для зрелого протеина. У

3 -конца P!F12 является полным Р?НIО

7 также содержит весь 3 -регион "УИ- P — .

-кДНК, включая поли(аА последовательпроисходящую оТ поли(А,PIIK, Р2НIО простирается однако еще зам тнее ;1400 п.о,, 3 поли йА лежит в (7 ( одной области с послсдовательностью олиго{йС), следуя от последовательности неизвестного происхождения, анализ ДНК-последовательности различных отрезков этого дополнительного региона Р2НIО не дает гомологии с ТРИ-Ргеном. Перекрестно гибридизированные с клоном P2HIO клоны РIС12 и Е52Е1 гибридизируются и с дополнительным регионом Р2Н10, а не с частью ХУИ-,5.

Пример 8. Клон РIА6 гнбридизируют с вирус-индуцированной намальва-РНК в регионе 12-!4 S. Он содержит вставку кДНК приблизительно

900 п.о., которая, как показал рестрикционныи анализ, не имеет сайта рестрикции для BamHI, Зц? ХХ, Есо

RI, Hind III, PstI u Pvu II, Доказательство того, что клон

РIА6 содержит IFN->-последовательi ность получают путем анализа ДНКС последовательности. Последовательность кДНК-вставки Р!А6 определяют сравнением с ТРИ-< -последовательностью. Оказалось, что клон РIА6 содержит на 49 пар оснований более короткий вариант LeIFNC. Наличие поли-(А)последовательности у 3 -конца РIА6 указывает на то, что клон Р2А6 произонел от более короткой иРНК, чем опубликованный клон LeIFN C.Регион кодирования LelFN C, содержится в плазмидной ДНК.

Пример 9. Клон PIA6 — единственный ?711-к-тип клона индентифицируют иэ коллекции !90 тридекануклеотидпозитивных клонов. Гибридиэуют 1800 клонов первоначального

1346048

Составитель Н.Кузенкова

Редактор Л.Веселовская Техред И.Верес

Корректор В.Бутяга

Тираж 500

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Рау»»»ская наб., д. 4/5

Заказ 5728

Подписное производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Полученные таким образом плаэмнды применяют для трансформации Е. coli

HBl01 и испытывают продукцию интерферона отдельных трансформантов. Получают увеличение экспрессии интер4 ферона приблизительно до 10 -кратного значения спонтанной экспрес сии.

Формула изобретения

Способ получения клона бактерий

Fscherichia coli, трансформированно- го плазмидой рВВ322, содержащей

15 вставку Pst- l, кодирующую интерферон е», или Р включающий получение Арагментов кДНК, содержащих кодирующую последовательность для генов »,- и -интерферона, путем выделения иРНК иэ индуцированных вирусом Сендай клеток В-лимфоцитов синтеза на матрице поли(А) PHK кДНК с помощью обратной

+ транскриптазы, получения на основе одн. кДНК дн. ДНК в присутствии ДНК полимеразы 1, которую далее обрабатывают $-нуклеазой и присоединяют к

3 -концу этой ДНК олигодезоксицитидин для нуклеотиды с помощью концевой дезоксирибонуклеотидилтрансферазы, вставку полученного фрагмента в плаэмиду рВН322, которую предваритепьно обрабатывают эндонуклеазой

P t-1, H-l нуклеазой, и к 5 -концу которой присоединяют олигодеэоксигуанидин нуклеотиды и трансформацию полученными гибридными плазмидами щтамма Е. coli НВ101 с последующим отбором нужного клона, о т л и ч аю rq и и с я тем, что, с целью одновременного отбора клонов, несущих рекомбинантные молекулы ДНК с геном, кодирующим и Р --интерферон, иРНК выделяют из клеток р -лимфоцитов

Namalwa по истечении 9 ч после индукции вирусом, синтез кДНК осуществляют на (А) РНК с величиной молеку». лы 6 и 18 S, получают дн. ДНК размером 600 п.о., а выбор клона, содержащего комплементарную последовательность к тридекануклеотиду, меченному радиоактивным фосфором, с формулой

5 CCTTCTGGAACTCr-3 осуществляют прямой гибридизацией с последующей идентификацией клона, содержащего рекомбинан"ные молекулы ДНК с геном, кодирующим интерферон g, и Р