Способ получения рекомбинантной днк,кодирующей нуклеотидную последовательность инсулина

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К IlATEHTY

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 2620106/28-13 (22) 26.05.78 (31) 801343 (32) 27.05.77 (33) US (46) 30.04.87. Бюл. Р 16 (71) Дзе Риджентс оф дзе Юниверсити оф Калифорния (VS) (72) Вильям Дж. Раттер, Говард Майкл.

Гудман, Джон Митчелл Чергвин (US)

Аксель Ульрих, Питер Хорст Зеебург (DE), Джон Шайн (AU), Рэймонд Луис и Пикнет (СН) (53) 575(086.8) (54) (57) 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНК, КОДИРУЮЩЕЙ НУКЛЕОТИДНУЮ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ИНСУЛИНА, заключающийся в том, что ткань поджелудочной железы инкубируют в присутствии ингибитора трипсина и коллагеназы, выделяют островковые клетки, гомогенизируют их при рН 5,0-8,0 в присутствии PHK азоингибирующей ком,.SU „„ l 308199 А 3 (50 4 С 12 N 15/00 позиции, содержащей 4М гаунидинтиоцианат и 0,05-1,0 М р -меркаптоэтанол, выделяют м-PHK синтезируют к ней

k-ДНК, затем полученный дополнительно вектор переноса ДНК подвергают гидролизу в присутствии эндонуклеазы рестрикции Hind III, Hsu I или KCoR I при рН 7,6 и температуре 37 С в течение 2 ч, инкубируют k-ДНК и гидролизованный вектор переноса ДНК при рН

7,6 и температуре 14 С в присутствии

ДНК-лигазы и АТФ в течение 1 ч и выделяют целевой продукт.

2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю— шийся тем, что, с целью повышения эффективности ферментативного соединения k-ДНК с гидролизованным вектором переноса ДНК при одновременном уменьшении числа выбранных рекомбинантов, гидролизованный вектор пе реноса ДНК до инкубирования с k-ДНК инкубируют в присутствии щелочной фосфатазы при рН 8,0 и температуре

65 С в течение 30 мин.

1308199

Изобретение относится к генной инженерии и может быть использовано в медицине.

Целью изобретения является разработка способа получения рекомбинантной ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность инсулина, а также повышение эффективности ферментативного соединения k-ДНК с гидролизованным вектором переноса при одновремен— 1О ном уменьшении числа выбранных рекомбинантов.

Пример 1. В поджелудочную железу крысы под наркозом вводят солевой раствор Хенкса с помощью обрат1 5 ного вливания в проток железы. Затем поджелудочную железу удаляют, дезагрегируют в растворе Хенкса при

00С и обрабатывают коллагеназой и ингибитором трипсина, полученного из соевых бобов. Все стадии осуществляют при 0-4 С, если не оговорено иначе.

Две измельченные поджелудочные железы вместе с раствором Хенкса объемом

8 мл помещают в стеклянную пробирку объемом 30 мл. Все стеклянные пробирки предварительно обрабатывают силиконом. Смесь для выращивания содержит 12 мг коллагеназы - фермента, выделенного из CJ.ostridium histolyticum, и 1 мг ингибитора трипсина. Выращивание осуществляют при 37 С в течение 25 мин при встряхивании со скоростью 90 тактов в минуту при постоянном контроле процесса ферменто- 35 лиза. После инкубации пробирку центрифугируют со скоростью 200 С в течение 1 инуты. Верхний слой сцеживают, а осадок промывают раствором

Хенкса, процедуру отмывки повторяют

5 раз. Осадок после промывки суспендируют в 15 мл фикола с плотностью

1,085. Затем добавляют 8 мл фикола с плотностью 1,080 и 5 мл фикола с плотностью 1,060. Пробирку последо- 45 вательно центрифугируют 5 мин со скоростью 500 G и 5 мин со скоростью

2000 G. Искомые клетки поднимаются по градиенту плотности и образуют колонию между двумя верхними слоями.

Клетки содержат примеси клеток ганглиона, лимфатических узлов и соединительной ткани, которые должны быть удалены, например, микропипеткой под контролем микроскопа. 55

Препарат клеток разбавляют раствором Хенкса и центрифугируют. Осадок клеток эамораживают в жидком азоте.

Искомые клетки, выделенные из поджелудочной железы 200 крыс, гомогенизируют в растворе, содержащем 4М гуанидинтио-ционата и 1М р -меркаптоэтанола; буферный раствор обеспечивает рН 5,0; температура раствора 4 С. Полученный гомогенат наслаивают на

1,2 мл 5,7 M раствора хлорида цезия, содержащего 100 мМ ЭДТА, и затем центрифугируют 18 ч со скоростью

37000 об/мин ° PHK оседает на дно пробирки.

Полиаденилированную PHK выделяют с помощью хроматографического анализа всего препарата PHK на олиго(дТ)-целлюлозе.

Обратную транскриптазу используют для копирования полной молекулы полиаденилированной РНК, полученной из области Лангерханса крысы, на k-ДНК.

Реакцию осуществляют в .растворе, содержащем 50 мМ трис-НС9 (рН 8 3)

9 мМ MgCQ, 30 мМ NaCf, 20 мМ р-меркаптоэтанола, 1 мМ каждого из трех нерадиоактивных деоксирибонуклеозидтрифосфатов, 250 мМ четвертого деоксинуклеозидтрифосфата, меченого g â€, 32 р с удельной радиоактивностью 50—

200 Ки/моль, 20 мкг/мл олиго-дТ 2

100 мг/мм полиаденилированной PHK u

200 ед/мл обратной транскриптазы.

Смесь инкубируют при 45 С в течение

t5 мин. После добавления 25 мИ ЭДТАNa2 раствор экстрагируют насыщенным водой фенолом. Водяной слой хроматографируют на сефадексе G †1 в колонке высотой 10 см и диаметром 0,3 см в смеси 10 мИ трис-HC K рН 9,0, 100 мМ

МаС1, 2 мМ ЭДТА. Нуклеиновую кислоту из элюата осаждают этанолом после добавления ацетата аммония до 0,25 И, рН 6,0. Собирают осадок при помощи центрифугирования. Осадок растворяют в 50 мМ свежеприготовленного 0,1 М раствора NaOH и инкубируют при 70 С в течение 20 мин для гидролиза PHK.

Смесь нейтрализуют 1М раствором ацетата натрия (рН 4,5) и полученную

32 -k-ДНК осаждают этанолом и повторР но растворяют в воде. Отдельные порции k-ДНК, состоящей из одной нити, анализируют на натуральных полиакриламидных гелях или сушат, и ДНК, меченую 32р, анализируют с помощью авторадиографии с использованием пленки

Kodak Ф вЂ” screen-2Ò. Установлено, что

k-ДНК представляет собой гетеродисперсоид, содержит по крайней мере

1308199 один известный тип k-ДНК, молекула которой содержит около 450 нуклеотидов.

Пример 2. Полученную в примере 1 k-ДНК, состоящую из одной нити, обрабатывают обратной транскриптазой для синтеза комплементарной нити. Реакционная смесь содержит 50 мМ трис-HCR (рН 8,3), 9 мИ MgCE, 10 MM дитиотрейтола, 50 мМ трех немеченных 10 деоксирибонуклезидтрифосфатов, 1 мМ меченого 32 в порции нуклеозидтриP фосфата с удепьной радиоактивностью

1- 10 Ки/ммоль, 50 мкг/мл k-ДНК и

220 ед/мл обратной транскриптазы. Ре- 15 акционную смесь инкубируют при 45 С о в течение 120 мин. Реакцию останавливают добавлением ЗДТА-Na до 25 мМ, экстрагируют фенолом и подвергают хроматографическому анализу на сефа — 20 дексе С-100, а затем осаждают этано— лом. Порции продукта реакции с показателем от 500 до 1000 отсчетов в минуту анализируют с помощью электрофореза на геле. Полоса поглощения ге-25 теродисперсоида сосредоточена вокруг

450 нуклеотидов по длине.

Порции ДНК, полученные по примерам 1 и 2, порознь обрабатывают пищеварительными ферментами с избытком 30 эндонуклеазы ограниченная Нае ТХХ и аналогичным образом анализируют с помощью гелевого электрофореза. Молекулы обоих продуктов рассекают эндонуклеазой. Полосы, полученные в ре- 35 зультате рассечения молекулы k-ДНК из двух нитей, имеют ту же длину, что и полосы, полученные при анализе рассеченной молекулы k-ДНК, состоящей из одной нити. 40

Пример 3. Полученную в примере 2 молекулу из двух нитей с концентрацией 2-5 мкг/мл обрабатывают

30 ед. нуклеазы Sl, имеющей активность 1200 ед/мл, в смеси, содержащей 45

0,03 M ацетата натрия (рН 4, 6), 0,3 М

NaC(, 4,5 M ZnC3 при 22 С в течение 30 мин, а затем инкубируют в течение 15 мин при 10 С. Реакцию останавливают добавлением трис-основания 5Ц до конечной концентрации О, 1 М, ЗДТА до 25 мМ и т-РНК, выделенной из Е.содо 40 мкг/мл. После экстрагирования этанолом реакционной смеси и хроматографиче с ко го анализа на сефадексе 55

С вЂ”.100 32 — k-Д11К, элюированную в пустой объем, осаждают этанолом. Такая обработка обеспечивает высокий выход молекул с ДНК, концы которой связаны основанием. Лигацию декамера Н1пс1 Т?1 с k ÄÍK осуществляют инкубацией при

14 С в смеси 66 мМ трис-НС((рН 7,6), 6,6 мМ MgCQ, lмМ АТФ, 10 мМ дитиотрейтола, 3 мМ декамера Hind III c показателем 1О< отсчетов в мин/мол и лигазы ДНК Т4 приблизительно 500 ед/мл

»а протяжении одного часа. Для дезактивации лигазы реакционную смесь нагревают до 65 С в течение 5 мин.

Предварительно к пищеварительным ферментам, содержащим 1.50 ед/мл НБц I или Н пй III, добавляют КС 1 до конечной концентрации 50 мМ, деактивируя лигазу, р -меркаптоэтанол до конечной концентрации 1 MM и ЗДТА до конечной концентрации 0,1 мМ, смесь выдерживают 2 ч при 37 С. Продукт реакции анализируют электрофорезом на геле.

Обнаружен пик, соответствующий последовательности приблизительно 450 нуклеотидов наряду с отдельными фрагментами рассеченного декамера Н1пй? Т1.

Пример 4. Плазмид рМВ-9 ДНК рассекают в месте узнавания для

Hind III эндонуклеазой HSu 1, затем обрабатывают щелочной фосфатазой типа BAPF. Фермент присутствует в реакционной смеси в концентрации 0,1 ед/мкг

ДНК; смесь инкубируют в 25 мМ трисHCE. при рН 8 в течение 30 мин при

65 С, затем для удаления фосфатазы экстрагируют фенолом. После осаждения этанолом фосфатазу, обработанную плазмидой ДНК, добавляют в k-ДНК, содержащую фермент Hind III, соединяющий концы молекулы, в молярном отношении 3 моль плазмиды на моль k-ДНК.

Смесь инкубируют в растворе, содержащем 66 мМ трис-HCE (рН 7,6), 6,6 мМ

ИяСР,, 10 мМ дитиотрейтола и 1 мИ

АТФ, в течение 1 ч при 14 С в присутствии 50 ед/мл лигазы ДНК Т4.

Смесь, в которой протекает лигация, добавляют в суспензию штамма

Е.со 0i х-1776. Предварительную культуру Е.cori выращивают до удельной плотности 2 1О кл/мл в 50 мл среды, содержащей триптон 10 г/л, экстракт дрожжей 5 г/л, NaCR 10 г/л, ИаОН 2 мМ, диаминопимелиновую кислоту 100 мкг/мл и тимин 40 мкг/мл, при

37 С. Клетки отделяют центрифугированием в течение 5 мин со скоростью

5000 G при 5 С, осадок суспендируют в 20 мл холодного раствора 10 мИ ИаС1, повторно центрифугируют в. тех же ус1308199

Корректор И. Муска

Заказ 1645/58 Тираж, 500 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

У

Производственно-полиграфическое предприятие, г ° Ужгород, ул. Проектная, 4 ловиях, вновь суспендируют в 20 мл буфера трансформации, содержащего

75 мМ СаС1, 140 мМ НаС и 10 мМ трис, рН 7,5, затем смесь выдерживают 5 мин на льду. Клетки центрифугируют и 5 вновь суспендируют в 0,5 мл буфера трансформации. Трансформацию осуществляют путем смешения 100 мл суспензии клеток с 50 мл рекомбинанта ДНК (1 мкг/мл). Смесь инкубируют при 0 С в течение 15 мин, затем 4 мин при

25 С и 30 мин при 0 С. Затем клетки переносят на питательную среду для выращивания в селективных условиях.

Отбор клеток для рекомбинй1 ованной 1> плазмиды осуществляют в условиях, когда в среде присутствует тетрациклин в концентрации 5 мкг/мл, с целью трансформации мест узнавания фермента Hind ?ХТ. Выделяют рекомбинант 20

paU-1. Препараты неочищенной плазмиды, содержащие 2-5 мкг ДНК, и выделенной из рекомбинанта pAU-1 обрабатывают избыточным количеством эндонуклеазы $1. В препараты добавляют

ЭДТА-Na до конечной концентрации

10 мМ и 101-ный раствор (в/о) цукрозы. Смесь наносят на 8 -ный полиакриламидный гель. ДНК имеет примерно

410 пар оснований по длине. 30

Пример 5. ДНК, полученную из pAU-1 (пример 4), подвергают очистРедактор М. Келемеш Техред М.Ходанич ке электрофореэом на 67-ном полиакриламидном геле. После элюирования из геля ДНК метят путем инкубирования с Ъ.-32 -АТФ и ферментом (полинуклеотидной киназой), выделенным из штамма Е.CoPi. Меченую ДНК рассекают эндонуклеазой НаД II и два меченых

1 фрагмента молекулы ДНК, содержащих примерно 265 и 135 пар оснований., отделяют на полиакриламидном геле в условиях примера 1. Выделенные сегменты подвергают специальной реакции рассечения и последовательность анализируют. В последовательности на конце 5 содержится еще одна последо" вательность, содержащая 50-120 нуклеотидов по длине, а сегмент поли дА на конце 3 имеет переменную длину.

Соответствующая последовательность аминокислот проинсулина 1 крысы начинается и заканчивается триплетом.

Пример 6. Выделяют последовательность нуклеотидов, содержащую генетический код, контролирующий синтез инсулина человека. Последовательность очищают и вводят в плазмиду (согласно (примеров 1-4).,Микроорганизм готовят .по примеру 4 и они содержат нуклеотидную последовательность с информацией, контролирующей синтез цепи инсулина А и цепи В человека.