Способ получения термически устойчивой бактериальной @ - амилазы

 

Изобретение относится к спосо- , бам получения ферментных препаратов «(-амилазы и может быть использовано в химической, ферментной или пищевой промьшшенности. Цель ияобретения - повышение активности ai -амилазы.Сущность изобретения заключается в том, что в качестве продуцента термоста- , бильной J, -амилазы используют штамм Bacillus licheniformis АТСС 39326, который культивируют в питательной среде, содержащей источники углерода , азота, минеральные компоненты и воду при рН 5,5-8,0, причем в качестве источника углерода предпочтительно используют лактозу в концентрации 5-15 мас.%. Изобретение позволяет получить -амилазу с активностью 1500-2000 ликфон-мл или 10000 SKB единиц/мл после 72 ч культивирования продуцента. 1 з.п. ф-лы. Ct (О О) 4: 4 Ю iU 1 СМ

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (1Ю (11) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТ

К flATEHTY

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

IlO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3749933/28-13 (22) 06.06.84 (46) 07.10.87. Бюл, № 37 (71) Набиско Брэндз Инк (US) (72) Роберт О.Ховарт (US) (53) 663.15 (088.8) (56) Бечина Е.М,, Логинова Л.Г., Гернет M.В, Отбор продуцентов амилолитических ферментов среди термофильных микроорганизмов. — Прикладная биохимия и микробиология, 1982, 18, № 5, 640-647.

Fogarty W,M., Kelly С.I. Amylases, amyloglucosidases and related

glucanases. — Microb. Enzymes and

Bioconvers, London е,а., 1980, 115

170.

Патент Англии ¹ 1296839, кл. С 12 D 13/10, опублик. 1971. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТЕРМИЧЕСКИ УСТОЙЧИВОЙ БАКТЕРИАЛЬНОЙ i, — АМИЛАЗЫ (57) Изобретение относится к способам получения ферментных препаратов (-амилазы и может быть использовано в химической, ферментной или пищевой промьппленности. Цель изобретения— повышение активности (. — амилазы,Сущность изобретения заключается в том, что в качестве продуцента термостабильной J, --амилазы используют штамм

Bacillus 1icheniformis АТСС 39326, который культивируют в питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные компоненты и воду при рН 5,5-8,0, причем в качестве источника углерода предпочтительно используют лактозу в концентрации 5-15 мас.X. Изобретение позволяет получить, -амилазу с активностью 1500-2000 ликфон-мл или 10000

БКВ единиц/мл после 72 ч культивирования продуцента. 1 з.п. ф-лы, 1344247

Изобретение относится к способам получения ферментного препарата

4-амилазы иможет быть использовано в промышленности моющих средств и при конверсии крахмала в водорастворимые углеводы в химической, ферментной или пищевой промышленности, Цель изобретения — повьш ение активности -амилазы.

Способ заключается в том, что B качестве продуцента термостабиль— ной -амилазы используют штамм Bacillus licheniformis АТСС 39326, который культивируют в питательной среде, содержащей в качестве источника углерода предпочтительно лактозу в условиях рН среды 5,5-8,0 при аэрировании и перемешивании. Целевой про, дукт выделяют известными методами, Штамм Bacillus licheniformis хранится в Американской коллекции типовых культур микроорганизмов под номером AT СС 39326.

Испытываемые природные источники -амилазы высевают на среду, содержащую крахмал, цитрат, фосфат аммония т2 и небольшие количества Са и Mg

0 и выращивают при 41 С, Культуры исследуют на наличие осветленных зон вокруг колоний на агаре.. Культуры, характеризующиеся большими зонами, распыляют на большие пластины с крахмало — агаровой средой, содержащей агаровую среду с 0,57 гелеобразного крахмала Линтнера, 0,5% дрожжевого экстракта, 0,27 цитрата натрия, 0,5% фосфата аммония, 0,57 сульфата магния и 0,008% СаС1 . Н О, 1,5X araра при рН 7, и выращивают при 40 С в течение 24-48 ч, Снова собирают культуры, продуцирующие большие осветленные зоны и сравнивают с контрольной культурой В.licheniformis.

Культуры, выращенные в шейкерах в течение 5-8 сут, испытывают на альфа-эмилазную активность в диапазоне

150 разжижений/мл. Затем культуры, проявляющие адекватную активность, отбирают для проверки амилазной ако тивности при 87 С, Полученный штамм имеет типичные характеристики В,licheniformis, т,е.. является грамположительным, спорообразующим микроорганизмом, способным к анаэробному росту и использующим пропинат аэробно. Особенностью этого организма является то„ что его

4-амилаза не требует экзогенного

Са для активности при 87 С, а также его необычайно высокий уровень активности фермента при этой температуре, Сравнение коммерческого фермента

Клинтона и предлагаемого при 80 и о

95 С показывает, что для:получения желаемого уровня декстринизации за определенное время требуется меньшее количество фермента, Ферментацию обычно осуществляют в течение 2-6 дней при 25 — 55 С, с использованием обычных усвояемых источников углерода, азота и других питательных веществ, Подходящими источниками углерода являются углеводы (лактоза, глюкоза и крахмал) или ве-.. щества, содержащие углеводы, такие как соя, кукурузная мука и т.п. и их смеси, Количество углевода можно значительно изменять 1 — 25 мас, /об, предпочтительно от 5 — 15 мас.%/об.

Наиболее предпочтительным источником углерода является лактоза, поскольку в этом случае достигаются наилучшие показатели ферментной активности. Содержание лактозы в питательной среде 1 — 20 мас,7/об, лред— .почтителен диапазон 5 — 15 мас,7/об °

Лактозу можно использовать либо в качестве единственного источника углерода, либо в комплексе с другими источниками, такими как сыворотка и соевая мука, при этом концентрация последних должна составлять не менее

5 мас,X/oá.

Источник азота может быть органическим или неорганическим, например растворимые нитраты или соли аммония.

Источниками органического азота могут быть дрожжевой экстракт, кукурузный экстракт, мука земляного ореха и т,п, Иикроорганизм выращивают в питательной среде в аэробных условиях, которые обеспечивают путем аэрирова— ния бродильных сосудов, обычно при скорости один объем воздуха на объем среды, Фермент вьщеляют из реакционной среды после достижения требуемых уровней ферментной активности известными способами, например осаждением фермента с использованием известных осадителей, таких как сульфат натрия или несмешиваемые с водой органические растворители ацетон или этанол, В результате центрифугирова1344247 ния или фильтрования осадка с последующей его сушкой получают очищенныйтвердый фермент °

Способ осуществляют следующим об5 разом.

Bacillus licheniformis АТСС 39326 сеют штрихом на пластинку крахмального агара Difco и выращивают при

40 С в течение 18 ч. 10

Суспензией клеток инокулируют бульон следующего состава, Е: дрожжевой экстракт 0,5; триптон 0,5;

К НРО 0,1; D ãëþêîçà 0,1. 350 мл на колбу емкостью 1 л. Культивируют )5 о при 40 С в течение 1-2 дней при скорости вращения 200 об/мин, на встряхивателе Брансвик G — 50 (2 †орби).

Все содержимое колбы используют в качестве прививочного материала в объеме 3150 мл среды, имеющей следующий состав, 7.: лактоза 10; К НРО

1,4 (лактозу и К,HP04 обрабатывают в автоклаве отдельно от других компонентов); КН РО 0,6; (МН ) SOp 0,6; 25 цитрат натрия 0,3; соевая мука 3,0;

СаС1. 2Н 0 0,05; 1,0 мл MAZujP

6000 — пеногаситель. Исходное значение рН 6,8 — 7,0.

Среду стерилизуют в автоклаве в о течение 60 мин при 121 С, общее количество 6,8 кг, Для оптимального получения (-амилазы рН культуральной среды должен быть ниже 8 0, но не ниже 5,5.

Для контроля за возможным вспениванием при размножении предусмотрен противовспениватель MaZugF 6000.

Условия ферментации: скорость пе- 4п ремешивания 600 об/мин, температура

0 культивирования 40 С, аэрация среды

1 л об/об, воздуха, рН через 72 ч

6,5 — 7,0.

Измерение активности фермента 4б -амилазы осуществляют с помощью . стандартной технологии, Один иэ таких методов представляет собой видоизмененный метод Вохлегермута, при котором активность определяют во времени 50 вываривания, необходимого для изменения окраски, характеризующего определенную стадию декстринизации крахмала. Метод тарируют так, что кон-. центрацию амилазы можно рассчитать непосредственно в ликфонах на грамм.

Аналитическое определение содержания -амилаэы в ликфонах производят следующим образом, Фиксируют время и разбавление по завершении реАкции и рассчитывают активность в ликфонах на грамм или

1 мл.

Расчет ферментативной активности производится по следующей формуле:

1140

Ликфоны

{или мл) Х растворение

Фактический вес (или объем в мл) пробы, Х вЂ” время декстринизации, мин.

Готовят пробу раствора с использованием в качестве растворителя и разбавителя 0,025 M раствора СаС1 так, что для 5 мл готового разбавленного раствора время декстринизации составляет 10 мин. Если приблизительная активность ферментного препарата не известна, надлежащий размер пробы и/или степень разбавления необходимо определить экспериментальным путем.

Вносят 5 0 мл разбавленного иодного раствора в пробирки диаметром

13 мм и высотой 200 мм, которые помещают в водяную баню с температурой

30 С. Вводят 10 мл крахмала Линтнера в пробирку диаметром 23 мм и высотой

200 мм и помещают ее в водяную баню о с температурой 30 С.

25 мл разбавленного раствора

А-амилазы вносят в пробирки 23 х х 200 мм и ставят их в водяную баню о с температурой 30 С, 5 мл разбавленной пробы неизвестного фермента добавляют в 10 мл раствора крахмала и после добавления половины неизвестного раствора -амилазы пускают секундомер и затем вливают оставшуюся половину раствора из пипетки.

В соответствующие интервалы времени в пробирку, в которой находится отрегулированный разбавленный иодный раствор, добавляют 1 мл гидролизующий смеси (крахмал, раствор †амилаэы),Встряхивают содержимое, выливают его в калиброванную квадратную трубку (13 мм) и сравнивают со стандартным окрашенным диском в компараторе Геллиже, 1 мл вносят в йодный раствор для того, чтобы можно было более точно определить точку кипения. При приблизительном достижении времени точки кипения пробы необходимо извлекать через интервалы времени, равные

0,1 мин (6-12 с).

Составитель Е.Воробьева

Техред А.Кравчук Корректор А.Зимокосов

Редактор Н,Гунько

Заказ 4840/59

Тираж 499 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д,4/5

Производственно †полиграфическ предприятие, г.Ужгород, ул,Проектная, 4

Растворы, используемые при описанном анализе, получают следующим образом, Раствор крахмала. Растворимый крахмал Линтнера (10г) смешивают с

35 мл дистиллированной воды в колбе, которую затем нагревают до кипения и выдерживают в течение 5 мин при температуре кипения с постоянным перемешиванием. После этого раствор охлаждают до комнатной температуры и добавляют 125 мл ацетатного буферного раствора и достаточное количество воды, доводят общий объем колбы до

500 мл. Добавляют 1 мл толуола. Стабильность этого раствора проверяют с помощью стандартной пробы 1 -амилаэы известной концентрации, Ацетатный буферный раствор. Взвешивают 1 моль ацетата натрия (82,0г) и растворяют его в 800 мл воды, Доводят рН до 6,2+0,1 с помощью уксусной кислоты и разбавляют содержимое до л. При приготовлении 1 л крахмального субстрата требуется

20 мл раствора.

Разбавительный раствор хлористого кальция 0,025 М вЂ” растворяют

ll,1 г химически чистого безводного хлористого кальция в 4 л воды.

Буферный раствор, Растворяют

25,3 r гранул гидроокиси натрия и

340 г первичного кислого фосфата калия в дистиллированной воде и доводят содержимое в мерной колбе до 2 л.

При достижении буферным раствором комнатной температуры доводят содержимое до объема (рН 6,2 + 0,1).

Основной йодный раствор ° Раство— ряют 5,50 r химически чистых кристаллов йода и 11,0 r KI в Н 0 и разбавляют содержимое до 250 мл, Хранят раствор в темной бутыли.

Разбавленный йодный раствор, Растворяют 20,0 г KI в Н„О, добавляют

44247

2, 00 мл основного йодного раствора и разбавляют до 500 мл.

С помощью описанной методики активность полученной 1.-амилазы превышает 1500 — 2000 ликфон/мл против культуры В. licheniformis, 125 ликфон/мл, полученных в ферментативной

10 среде для известного продуцента в то время, как те же культуры демонстрируют даже более низкие активности, а именно ниже 50 ликфон/мл, в известной среде.

15 Другим методом измерения активности 1.-амилаэы является видоизмененная SKB технология. В этих единицах известные культуры продуцируют менее 500 SKB единиц/мл, в то время

20 как активность Bacillus licheniformis АТСС 39326 10000 SKB ед./мл, а

Формула изобретения

1, Способ получения термически устойчивой бактериальной oL — амилазы, предусматривающий культивирование продуцента бактерий Bacillus licheniformis в питательной среде, содержа30 щей источники углерода, азота, минеральные компоненты и воду, в условиях аэрации и перемешивания с последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что, Зб с целью повышения активности J. †àìèлазы, в качестве продуцента из вида

Bacillus 1icheniformis используют штамм бактерий Bacillus licheniformis АТСС 39326, а культивирование

40 осуществляют в условиях рН среды

5,5 — 8,0.

2. Способ по п,1, о т л и ч а ю— шийся тем, что в качестве источника углерода в питательной среде ис4б пользуют лактозу в концентрации 5

15 мас,X °