Способ выделения наружной и внутренней мембран возбудителя чумы
СОЮЗ СОВЕТСНИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ
РЕСПУБЛИН
„„Я0„„1292320 А1 (51) 5 С 12 N 1/00
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Н A ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ,(46) 15.10.90, Бюл. 9 38 (21) 3830373/28-14 (22) 20.1 1.84 (71) Ростовский"на-Дону государственный научно-исследовательский противо-. чумный институт (72) Н.В.Коробейник, Л.А.Абрамова и В.С.Цивин (53) 576.8.097(088.8) .(56) "Hutbert R.Е. et а1 Х.Bactexiol.
1984, 1Я, 1, р. 107-113.
Вагчеай R.P. et al I.Ââñtåtiîl, 1980, 143, 2, р. 942-949. ,(54)(57) СПОСОБ ВЬЩЕДЕНИЯ НАРУЖНОЙ
И ВНУТРЕННЕЙ МЕМБРАН ВОЗБУДИТЕЛЯ
Ф
ЧУМЫ путем выращивания клеток на скидкой питательной среде, разрушения клеток давлением через пресс, ультрацентрифугирования s градиенте концентраций сахароэы и сбора целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта и ускорения способа полученный экстракт после разрушения клеток подвергают дважды ультрацентрифугированию в двух последо« нательных градиентах концентрации сахарозы (70-20K) и (70-45X) при ускорении 120000-. 130000. g.
Составитель. И.Красильников
Техред Л. Олейник Корректор Г. Решетник
Редактор A.Êóïðÿêîâ 1. Заказ 4362 Тираж 490 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035, Москва, 3"35, Раушская наб., д. 4/5
Производственно-полиграфическое в, r.Ужгород, ул.Проектная, 4
12923
Изобретение относится к области биотехнологии и касается вьщеления наружной и внутренней мембран грамотрицательных микроорганизмов.
Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта и ускорение способа за счет модификации эта па выл ел ения .
Пример. Клетки чумного микроба (штамм EV) выращивают в сис- 10 теме непрерывного культивирования в бульоне Хоттингера, рН 7,2 при
28 С и 37 С до середины логарифмической фазы развития и биомассу собирают центрифугированием в течение 15- 15
20 мин при 5000-6000 g. Клетки отмывают буфероч (0,01 М трис-НС1, рН
7,2; 0,02 M МвС 0,03 М 2-меркаптоэтанол) и оставляют в осадке при минус 20 С до использования. 20
Замороженные осадки (8-10 г бактериальной массы) суспендируют в
30 мл трис-НС1-буфера, рН 8,0, содержащего 20Х сахарозы, добавляют
РНКазу и ДНКазу (2 мг на 1 r клеток), инкубируют 30 мин при 4 С и дважды пропускают через Х-пресс (давление 16 т) в замороженном состоянии.
Обломки клеток и неразрушенные клетки удаляют центрифугированием при 1300-1400 g в течение 10 мин.
Кле-.очные оболочки (общая фракция мембран) вьщеляют центрифугированием супернатанта при 120000 g (ротор 35 ,SW- 27, .ультрацентрифуга Ь 5-6 ) в течение 1 ч в ступенчатом градиенте .сахарозы, содержащем 9 мл 70Х-ной са20
2 харозы (я/объем) и 23,5 мл 20Х-ной сахароэы (в/объем). Плотный оранжевый слой, расположенный в центре пробирки, отсасывают с помощью шприца и используют для дальнейшего фракционирования.
Вьщеленную фракцию оболочек или суммарных мембран (наружные и цитоплазматические) промывают О, 01 М трис-НС1-буфером, рН 8,0, содержащим .0,01 М дитиотреитола и 5 10 М Hg и наслаивают на верх линейного сахарозного градиента (70-45X) (общий белок 200 мг). Градиенты приводят в равновесие эа 6 ч на ультрацентрифуге Ь 5-65, используя ротор SW-27 и ускорение 120000 g. За это время материал отчетливо распределяется в два кольца. Оранжевый слой и серовато-белый на 0,5 см ниже первого, которые представляют собой материал внутренних и наружных мембран. Проводят измерение оптической плотности при 280 нм íà Uvicord II после раскапывания (по 10-12 капель), полученных последовательно фракций градиента, которые в дальнейшем собирают и отмывают в трис-НС1-буфере, рН 8,0, содержащем 5 10 И8 и 0,01 М дитиотреитола. Выделенные чистые препараты наружных и внутренних мембран хранят при минус 20 С.
Способ позволяет в 3 раза по срав.нению с прототипом ускорить процесс получения мембранных фракций с высокой степенью чистоты и увеличить выход конечного продукта в 4 раза.
