Способ определения активности антитромбина-вм

 

Изобретение относится к медицине , а именно к способу опр еделения активности антитромбина-ВМ. Цитратную плазму разбавляют 0,9%-ным раст вором NaCl. Готовят антитромбинную (AT) реакционную смесь. В пластмассовые кюветы вносятся растворы АТ-реакционной смеси и 0,9%-ного NaCl в одном случае и разбавленная плазма и AT-реакционная смесь в другом случае. Эти смеси инкубируют в течение 5 мин и смешивают с 1,9 ммоль хромозима ТН. В течение 30 с определяют начальную экстинкцию. Через 30, 60 и 90 с повторяют измерение. Из разницы между коэффициентами экстинкции определяют среднее значение. Таким образом, получают общую антитромбинную активность . При повторении измерения с пониженной концентрацией гепарина получают AT-III о Из разницы между СО общей антитромбинной активностью и с AT-III получают количество антитромбина-ВМ , 5 табл. 1 ил. ю со со

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК ЬВ 4 G 01 N 33/52

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

«« «««В««««у«»

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕ ГЕНИЙ И OTHPbITHA (21) 3450446/28-14 (86) PCT/DE 81/00170 (08,10,81) (22) 08.06,82 (31) Р 3038163,6 (32) 09.10.80 (33) DE (46) 15.11.86. Бюл. Ф 42 (71) Берингер Маннхайм ГМБХ (DE) (72) Хельмут Лилль, Врген Шренк и Петер Вундервальд (DE) (53) 612.115.12:612.015..1(088.8) (56) Патент ФРГ 30 38 163, кл. С 07 G 7/00,,опублик. 06.05.82. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ

АНТИТРОМБИНА-ВМ (57) Изобретение относится к медицине, а именно к способу определения активности антитромбина-ВМ. Цитратную плазму разбавляют 0,97, -ным раст„„SU „„12713?9 А 3 вором NaC1. Готовят антитромбинную (AT) реакционную смесь. В пластмассовые кюветы вносятся растворы АТ-реакционной смеси и 0,97-ного NaC1 в одном случае и разбавленная плазма и

АТ-реакционная смесь в другом случае.

Эти смеси инкубируют в течение 5 мин и смешивают с 1,9 ммоль хромозима ТН °

В течение 30 с определяют начальную экстинкцию. Через 30, 60 и 90 с повторяют измерение. Из разницы между коэффициентами экстинкции определяют среднее значение. Таким образом, получают общую антитромбинную активность. При повторении измерения с пониженной концентрацией гепарина получают AT-III. Из разницы между общей антитромбинной активностью и

AT-III получают количество антитромбина-ВМ. 5 табл. 1 ил.

1271379

Изобретение относится к способу определения активности нового ингибитора тромбина, который называется антитромбином-ВМ (AT-BM), Определение AT-ВМ основано на 5 использовании различия в специфичности по отношению к AT-IlI в случае различных кофакторов. К испытуемому раствору добавляют кофактор антитромбина - ВМ, тромбин и опре,деляемый субстрат тромбина и по ко|личеству продуктов расщепления субстрата тромбина судят об активности антитромбин -BM.

Пример 1, 9 ч, свежеотоб- 15 ранной крови смешивают с 1 ч, 0,11 моль/л цитрата натрия и центрифугируют при 3000 об./мин. 201Фл полученной цитратной плазмы разбавляют 1,0 мл 0,9 -.ного раствора Мв,Cl. 20

5 мл раствора, содержащего

0,1 М трис/НС1, рН = 8,1; 0,15 М

NaC1, 0,01 М ЭДТА, l полиэтиленгликоля, 6,5 IU апротинин/мл и 1,75 USP гепарина/mr, смешивают с 0,25 мл ра- створа тромбина с 0,5 ед/mr и оставляют стоять в течение 30 мин (ATреакционная смесь).

Проводят определение по следующей схеме при 25 С в кювете с толщиной слоя 1 см и при длине волны Н1 405 нм.

Измеряется прирост экстинкции по сравнению с воздухом. В одну пластмассовую кювету вносят пипеткой

0,10 мл 0,9%-ного ИаС1 и 2 мл АТ-ре-, 35 акционной смеси, а в другую - 0,10 mr разбавленной плазмы и 2 мл AT-реакционной смеси; смешивают и инкубируют в течение 5 мин при 25 С. Затем содержимое каждой кюветы смешивают с 4О

1,9 ммоль хромозима ТН - таз-гли-npoarg-pNA .(0,20 mr), в течение 30 с определяют начальную экстинкцию и одновременно включают секундомер. Через

30, 60 и 90 с повторяют определение. 45

Из разницы между коэффициентами экс= тинкции (Е/30с) определяют среднее значение.

Таким образом, получают общую антитромбинную активность. 5О

Путем повторения измерения с пс ниженной до 0,2 US Р/мл концентрацией гепарина получают концентраврпо

AT-III. Из разницы между общей антитромбинной активностью и AT-III no- M лучают количество AT-ВМ.

H p и м е р 2. Используют следующие растворы реагентов.

1. Буфер;. трис/НС1 100 ммоль/и, рН = 8,1; декстран".ónüôàò (м,в.

500 000) 1 мл/100 .«л; апротинин 6,5

lJ/mr (единица ингибитора: трипсин, хромозин ТН,, 25 С; NaC1 150 ммоль/л.

2. Тромбин 0,5 ед/мл, 3. Хромоэим ТН (тоз-гли-про-argpNA) 1,9 ммоль/л.

4. Смесь реагентов: трис/НС1

90 ммоль/л, pH=8,1; декстрансульфат

0,9 мг/100 мл; апротинин 5,9 IU/ìë;

NaCl 136 ммоль/л; тромбин

0,045 ед/мл.

Приготовление смеси реагентов, Смешивают в пластмассовой емкости и оставляют стоять примерно в течение

30 минут при 25 С 10 мл буфера (раствор 1) и 1 мл тромбина (раствор 2).

Подготовка пробы.

Для определения 1 ч. цитратной плазмы разбавляют 200 ч 0,9 -ного

NaC1 (например,50 мл плазмы и 10 мл

0,9 -ного раствора NaC1).

Условия определения: длина волны

Hg 405 нм; пластмассовая кювета, толшина слоя 1 см; температура измерения 25 С.

Измерение по сравнению с воздухом (прирост экстинкции).

Для каждой серии измерений требуется по меньшей мере одно холостое значение с тромбином (TL). B одну пластмассовую кювету вносят пипеткой

0,05 мл 0,9/-ного 11аС1 и 1 мл раствора 4, в другую -. 0,05 мл разбавленной плазмы и 1 мл раствора 4, смешивают, инкубируют в течение 5 мин при 25 С. Затем содержимое каждой кюветы смешивают с раствором 3 (TL

0,1 мл проба:= 0,1 мл) и рассчитывают АЕ/30 с; Ед /30 с — hЕпроБы/30 с=

/30 с х 951,1

Для определения готовят растворы

AT-III (концентрация 12,5 IU/mr при

25 С) и AT-ВМ (концентрация 12,1

IU/ìë при 25 С).

Эта концентрация соответствует нормальному содержанию AT-III в человеческой плазме.

Для того, чтобы показать специфичность определения в присутствии ATAT-III определение проводят как с раствором AT-:ÂÌ, так и со смесью обоих растворов.

Измерение AT-BM„

1 ч. раствора AT-ВМ разбавляют

100 ч. физиологического раствора

1271379

Таблица 2

Хромозим ТН

$2238

16,5 21,30 22,35

ll,58 14,90 15,60

ИаС1 0,05 мл пробы + 5,0 мч раствора ЕаС1) .

Из этого раствора готовят дальнейшие разбавления с физиологическим раствором поваренной соли (9 ч. ра- 5 створа AT-BM + 1 ч. раствора NaC1;

8 + 2; 7 + 3 и т.д. вплоть до конечного разбавления 1:1000), Постоянные объемы (0,05. мп) приготовленных разбавлений AT-ВМ затем используют в тесте, согласно которому измеряют внутри выбранных пределов пропорциональные величины подавления ЬЕ„,„ (см. чертеж).

Измерение AT-BM в присутствии

AT-III.

0,05 мл раствора AT-BM разбавля= ют 0,05 мп раствора AT-III и 4,95 мл физиологического раствора поваренной соли (соответственно 1:100 разбавле- 20 ние обоих компонентов).

Иэ полученного раствора готовят серию разбавлений аналогично описанному выше.

Постоянные объемы (0,05 мл) приготовленных разбавлений затем используют в тесте (см. чертеж).

Как видно из данных, приведенных на чертеже, наличие AT-III не влияет на результат измерений измеряется 30 только AT-ВМ.

Аналогичные результаты получают при использовании декстрансульфата, сложных эфиров мукополисахарида с полисерной кислотой, пентозанполи-. сульфатов или короткоцепочечных проязводных гепарина.

Пример 3. Влияние концентрации тромбина ка определение AT-III.

В качестве пробы применяли водный 4О раствор AT-III. Применяли реактив по примеру 1: трис-буфер, рН 8,11 геларин, 1,75 US Р/мл; субстрат

0,19 ммоль/л.

Результаты определения приведены 45 в табл. 1. .Т а б л и ц а .1

Пример 4. Влияние концентрации тромбина на определение AT-ВМ с с гепарином.

В качестве пробы приняли водный раствор антитромбина-ВМ. Применяли реактив по примеру l: трис уфер, рН 8,1; гепарин 1,75 US Р/мл; субсч рат 0 19 ммоль/л.

Результаты определения приведены в табл. 2.

Пример 5. Влияние концентрации тромбина на определение AT-ВМ с декстрансульфатом.

В качестве пробы применяли водный раствор антитромбина-ВМ. Применяли реактив по примеру 1: трис-буфер, рН 8,1; декстрансульфат, 10 мкг/мл; субстрат, 0,10 ммоль/л.

Результаты определения приведены в табл. 3.

Таблица 3

Хромоэим TH 9,51 38,94 63,70

S 2238 . — — . 6 70 26 60 44 62

l7 0 17,2 17,3

Хромозим ТН

$ 2238 (Н-Р-phe-pip-8rg-pNA) 11,9 12,04 12,11

Пример 6. Влияние концентрации декстрансульфата на определе-. ние антитромбина-ВМ.

В качестве пробы применяли водный раствор AT-BM. Применяли реактив по примеру 2: трис-буфер, рН 8,1; тром бин, 0,05 ед./мл субстрат

0;.19 ммоль/л.

Результаты определения приведены в табл. 4.

1271379

Т а б л н ц а 4

Определение AT-BM, IU/мл, в присутствии декстрансульфата, мыс г/мл

Субстрат

Хромозим ТН 36,14 44,70 43,76

25,29 31,29 31,43

S 2238

Таблица 5

0,038 0,076 0,114 0,152 0,190 0,285

0,123 0,144 0,156 0,158 0,157 0,155

Работу осуществляли с реактивом по примеру 1 (определение исходного значения тромбина в соответствии с укаэанным примером). Концентрация громбина в тесте составляла тромбина в тесте составляла

0,015 ед/мл.

Как показали экспериментальные данные, тест можно осуществлять при концентрациях субстрата 0,0190,28о ммоль/л.

Поскольку субстрат S 2238 имеет почти идентичное К вЂ” значение 9 х

М х 10 : моль/л, для этого субстрата действительна такая же граничная odласть.

Расчет концентраций тромбина, ге= ларина или декстрансульфата в тесте.

Определение концентрации тромб на 50 (ед/мл) производили, исходя от измеренного в тесте сигнала (qE/30 с), следующим образом: аЕ Ъ х2.

30 с бхЧ где Ч вЂ” примененный в тесте объем (2,30 мл);

Пример 7. Зависимость активности тромбина от концентрации субс рата-хромо зима ТН (тоэ-глипро — ар< рВА,)Км-значение 2 х10 моль/л.

Q — коэффициент экстинкции для п-нитроанилина(9,70 см7мкмоль ,Ч вЂ” объем пробы тромбина (AT-реакционная смесь 2,00 мл);

2 — фактор необходимый для того, чтобы получить Е/мин.

Если, например, получали сигнал тромбина Е/0,500/30 с, то в AT-pe1 акционной смеси концентрация тромбина составляла 0,12 ед/мл. При дальнейшем разбавлении примененной в тесте смесью (2,30 мл), концентрация тромбина в тесте становится равной

0,10 бд/мл.

Препарат гепарина характеризуется количеством 11$Р-единиц в 1 мл. Налримар, концентрация гепарина 1,00

USP/ìë в буферном растворе дает концентрацию 0,95 USP/ìë в АТ-реакционной смеси (a именно, 5,0 мл буферного раствора смешивают с 0,25 мл раствора тромбина), Тогда в тесте оказывается концентрация гепарина 0,83

USP/ìë, так как в тесте АТ-реакционную смесь разбавляют от 2 до 2,30 мл) 8.7 6 5 4 Я 2 1 g г Ъ

Составитель Е. Колмакова

Редактор Л. Веселовская Техред А.Кравчук Корректор С.Шекмар

Заказ 6258/60

Тираж 778 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

7 1271379 8

Декстрансульфат отвешивают в бу- Ф о р м у л а и э о б р е т е н и я

Ю ферчый раствор (например, 1 мг/100 мл Способ определения активности анРасчет концентрации в тесте проиэво- титромбина-ВМ, з а к л ю ч а ю— дят следующим образом: для получения m, и и с я в том, что к исследуемой реакционной смеси 10 мл буферного ра- цитратной плазме или сыворотке крови створа (раствор 1) смешивают с 1 мл добавляют 0,01-0,1 ед/мп тромбина, раствора тромбина (раствор 2); в ре- 0,076-0,285 ммоль/л его субстрата— зультате концентрация декстрансуль- (тоз-гли-про-аг8-pNA или Н-В-phe-pipфата в реакционной смеси (раствор 4), -arg-pNA) в буфере с рН 8, и

) вб еес Н81и становится равной 0,909 мг/100 мл. 10 25 мг/мл декстрансульфата или корот,В тесте реакционная смесь раэбавля- коцепочечных производных гепарина и ется от 1,0 до 1,15 мп. Таким обра- по количеству образующихся продуктов зом, концентрация декстрансульфата в расщепления субстрата тромбина судят ,тесте составляет 0,79 мг/100 мл, или о величине активности антитромбина7,9 мкг/мл. ВМ.

° .. АТ-ВМ