Способ выделения кишечных иерсиний

 

Изобретение относится к микробиологии . Цель изобретения - ускорение способа выделения кишечных иерсиний . Для приготовления питательного бульона используют 40,0-50,0 гидролизата рыбного сухого, 0,005-0,02 генцианвиолета, дистиллированную воду до 1 л. После 24 - 48 ч вьщерживания засеянной жидкой среды в холодильнике пересев делают на чашку со средой Эндо с добавлением гендианвиолета в концентрации 0,005 -. 0,02. Засеянные чашки инкубируют в термостате при 22 - 26°С в течение суток. Затем делают пересевы из выросших бесцветных колоний на дифференциально-диагностическую среду. Эта среда содержит питательный агар сухой , 35,0 - 40,0; сахарозу 9,0 - П,0; рамнозу 0,9 - 1,1; индикатор Андреда 38,0 - 42,0; дистиллированную воду до 1 л. Среду разливают в пробирки по 8 - 10 мл стерилизуют в автоклаве при давлении 0,5 избыточной атмосферы и температуре ПО С в течение 30мин. После стерилизации пробирки оставляют до застывания среды в слегка наклонном положении для получения скошенного столбика. Пересев колонии осуществляют уколом в столбик и штрихами по поверхности скошенной части среды. Учет производят после инкубации в термостате при 22 - 26°С в течение суток. Дифференцируют культуру по изменению цвета среды. При изменении цвета всей среды в пробирке до розового культура дифференцируется как lersinia enterocolitica ,. а при изменении только цвета столбика до розового - как lersinia psendotuberculosis. 1 табл.

СО1ОЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (so4 С 12М 1 00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

IICF ".

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3921027/28-14 (22) 04.06.85 (46) 23.10.86. Бюл. Ф 39 (71) Рязанский медицинский институт им. акад, И. П. Павлова (72) P. Н, Реброва, А. М. Цурган, А. И, Кузнецов, А, П, Тарарышкин и Л. В. Тарасова (53) 576. 8. 093. I (088, 8) (56) Авторское свидетельство СССР

В 988865, кл. С 12 N 1/00, 1983. (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ КИШЕЧНЫХ

ИЕРСИНИЙ (57) Изобретение относится к микробиологии. Цель изобретения — ускорение способа вьщеления кишечных иерсиний. Для приготовления питательного бульона используют 40,0-.50 0 гидролизата рыбного сухого, 0,005-0,02 генцианвиолета, дистиллированную воду до 1 л, После 24 — 48 ч вьщерживания засеянной жидкой среды в холодильнике пересев делают на чашку со средой Эндо с добавлением генцианвиолета в концентрации 0,005 - 0,02.

Засеянные чашки инкубируют в термостате при 22 - 26 С в течение суток..„Я0„„2 52>5 А1

Затем делают пересевы из выросших бесцветных колоний на дифференциально-диагностическую среду. Эта среда содержит питательный агар сухой

35,0 — 40,0; сахароэу 9,0 — 11,0; рамнозу 0,9 — 1,1; индикатор Андреда 38,0 — 42,0; дистиллированную воду до 1 л. Среду разливают в пробирки по 8 — 1О мл, стерилизуют в автоклаве при давлении 0 5 избыточной ато мосферы и температуре 110 С в течение 30 мин. После стерилизации пробирки оставляют до застывания среды в слегка наклонном положении для получения "скошенного" столбика, ПеФ ресев колонии осуществляют уколом в щ столбик и штрихами по поверхности скошенной части среды. Учет произво" дят после инкубации в термостате при

22 — 26 С s течение суток. Дифференцируют культуру ° по изменению цвета ф среды. При изменении цвета всей среды в пробирке до розового культура дифференцируется как Тегздп1а епГегоcolitica а при изменении только цвета столбика до розового - KaK Tersinia psendotuberculosis. 1 табл.

t 12652

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии.

Целью изобретения является ускорение способа выделения кишечных иерсиний.

Способ осуществляют следующим об" разом.

Для приготовления питательного бульона с генцианвиолетом используют гидролизат рыбный сухой, ген- 10 цианвиолет и дистиллированную воду при следующем соотношении компонентов Г/л3

Гидролизат рыбный сухой 40-50 15

Генцианвиолет 0,005-0,02

Дистиллированная вода До1л

Для приготовления исходного раствора генцианвиолета 1 r сухого порош- 20 ка генцианвиолета растворяют в 100 мл этилового спирта, раствор хранят в . стеклянном флаконе с притертой пробкой при комнатной температуре (срок хранения до 1 года) . Перед приготов- 25 лением питательной среды готовят рабочий раствор генцианвиолета, для чего в 1 л стерильной дистиллированной воды вносят 0,5 мл или 1 мл, или 2 мл исходного раствора генцианвиолета, в результате чего конечные, концентрации генцианвиолета составляют соответственно 8-10-20 мкг/мл.

Добавление рабочего раствора генцианвиолета проводят после стерилизации питательного бульона по известкой методике,и остывания среды.

Среда с генцианвиолетом являетсяодновременно питательной и селективной средой, так как генцианвиолет подавляет рост многих видов бактерий, кроме иерсиний, Эту среду можно использовать и в качестве консерванта, а также среды накопления, так как иерсинии сохраняют в ней жизнеспособность и размножаются в течение нескольких суток как в холодильнике (при 4 " 6 С), так и в термостате (при 22 — 26 С).

После 24-48 ч выдерживания засеянной жидкой среды в холодильнике, пересев делают на чашку со средой

Эндо с добавлением генцианвиолета при следующем соотношении компонентов, г/л:

Агар Эндо сухой 40-50

Генцианвиолет 0,005-0,02

Дистиллированная вода До 1 л

15 3

Для приготовления среды из исходного спиртового раствора генцианвио. лета, готовят рабочий водно-спиртовой раствор так же, как для жидкой питательной среды и добавляют его в приготовленную по стандартной прописи расплавленную среду Энда, которую после перемешивания и растворения генцианвиолета разливают в стерильные чашки Петри. Засеянные чашки инкубируют в термостате при 22-26 С в течение суток и делают пересевы из выросших бесцветных колоний на дифференциально-диагностическую среду, содержащую питагельный сухой агар, рамнозу, сахароэу, индикатор

Андреде и дистиллированную воду при следующем соотношении компонентов, г/л:

Питательный агар сухой 35-40

Сахароза 9-11

Рамноза 0,9-1,1

Индикатор Андреде 38-42

Дистиллированная вода До1л

Среду разливают в пробирки по 810 мл, стерилизуют в автоклаве при давлении 0,5 избыточной атмосферы и температуре 110 С в течение 30 мин.

После. стерилизации пробирки оставляют до застывания среды в слегка наклонном положении для получения "скошенного" столбика, Пересев колонии осуществляют уколом в столбик и штрихами по поверхности скошенной части среды ("косячка") . Учет производя после инкубации в термостате при 22 — 26"С в течение суток. Дифференцируют культуру по изменению цвета среды: при изменении цвета всей среды в пробирке до розового цвета культура дифференцируется как Iersinia entегоcolitica, а при изменении цвета столбика до розового — как Iersinia pseudotuberculosis.

Пример 1, Фекалии больного (0,3-0,5 r) засевают в пробирку с питательным бульоном с генцианвиолетом и помещают в холодильник на 24-48 ч, Такой первичный посев лучше делать в стационаре при поступлении больного до начала лечения. Затем производят высев иэ жидкой среды на чашку со средой Эндо и генцианвиолетом, ин— кубируют посев в термостате при 22о

26 С, Через сутки на среде Эндо с генцианвиолетом вырастают мелкие бес1265215

10 цветные колонии, их пересевают на дифференциально-диагностическую среду — скошенный столбик с рамнозой и сахарозой, Посевы инкубируют в термостате при той же температуре сутки.

Учет производят, оценивая цвет среды.

Иерсиния энтероколитика изменяет цвет всей среды (и столбика и косячка) до розового. Иерсиния псевдотуберкулеэис изменяет цвет до розового в столбике дифференциально-диагностической среды, а скошенная часть среды остается светло-желтой. Исследование серологических и других свойств выделенных иерсиний проводится по общепринятой схеме.

Пример 2. Пробу воды из открытых водоемов в количестве 5 мл засевают в 5 мл питательного бульона с генцианвиолетом и помещают в холов дильник при 4-6 С на 48 ч, Через двое суток делают высев из жидкой среды на чашку со средой Эндо и генцианвиолетом, которую помещают в термостат при 22-26 С на 24 ч. Дальнейшее 2s исследование проводят так же, как при посеве фекалий от больного.

Для проверки чувствительности и точности способа проведены исследования по обнаружению кишечных иерсиний в микробных ассоциациях, включающих в разных сочетаниях следующие виды: иерсинии; кишечную палочку, протей, шигеллу Зонне, стафилококк (стандартный штамм У 209), гриб кандида альбиканс, Посевные дозы иерсиний составляют: 10,100,1000 клеток на 1 мл, посевная доза ассоциантов—

1000 клеток/мл.

В таблице представлены результаты. количественного исследования по об"

40 наружению кишечных иерсиний в семи различных микробных ассоциациях, проведенные параллельно по известному и предложенному способам в динамике — через 1,2 и 5 сут при темпера45 туре холодильника и тармостата, где

1 — иерсинии, кишечная палочка, стафилококк 209, 2 — иерсинии, кишечная палочка, кандида альбиканс, 3 " иерсинии, кишечная палочка, шигелла Зон-50 не, 4 - иерсинии, кишечная палочка, протей, 5 — иерсинии, кишечная палочка, стафилококк 209, шигелла Зонне, 6 — иерсинии, кишечная палочка, ста" филококк 209, протей, 7 — иерсинии, кишечная палочка, стафилококк 209, шигелла Зонне, протей, кандида альбиканс, 4

Из таблицы видно, что при малой посевной дозе (10 клеток/мл) единичные колонии иерсиний выделяются иэ ас социации через 5 сут только при использовании предложенного способа, а по известному способу их обнаружить не удается. При средней посевной дозе (100 клеток/мл) выявляются десятки колоний на чашке в результате инкубирования посевов при 2226 С в течение 2-5 сут и единичные колонии — через 5 сут выдерживания в холодильнике, по известному способу обнаружить иерсинии не удается ни в одйом случае, При большой посевной дозе (1000 клеток/мл) предложенный способ является более чувстви1тельным и эффективным, так как позволяет обнаружить во всех исследованных ассоциациях кишечные иерсинии в достаточном количестве уже через l и 2 сут после госева, после инкубации при 22-26 С, в то время как при использовании известного способа, в этих условиях иерсинии высеваются через 5 сут, Иэ ассоциаций, выдерживаемых в холодильнике, единичные колонии кишечных иерсиний высеваются уже через сутки и через двое суток (14-18 колоний), а по известному способу они обнаружены через 5 сут и в количестве меньшем, чем по предложенному способу, Вторая серия контрольных опытов поставлена с фекалиями инфицированными кишечными иерсиниями. Инфицирующая доза кишечных иерсиний составляет 10 10 10, 10 посевная 2 3 4 5 доза фекалий — 0,3-0,5 г.

Способ позволяет выделить кишечные иерсинии при меньшей инфицирующей дозе (10 ), что хорошо видно при инкубации посевов в термостате (выделение с первых суток) и в меньшей степени — при выдерживании в холодильнике (выделение с третьих суток).

Для оценки эффективности способа выделения кишечных иерсиний из объектов внешней среды исследована 1251 проба воды открытых водоемов °

Способ обеспечивает выделение кишечных иерсиний из исследуемого материала при меньшем количестве исследований, сокращает время выдерживания первичного посева в холодильнике с 5-15 до 1-2 сут (для сточных вод — 3-4 сут), ускоряет выделение чистых культур кишечных иерсиний от больных и объектов внешней среды с

Среднее количество выросших колоний при посевных дозах, клеток/мл

Состав ассо

10 100 1000 10 100 1000 циаций

Известный способ

Предложенный способ

Условия инкубации 22 — 26 С 1 сут

26,1+1,2

21,3+0,8

27,1+1,4

24,6+1,7

21,0+0,9

25,4+1,l

24,8+1,9

2 сут

81,2+2,)

86,3+1,4

84,2+2,5

83,4+1,7

85,4+1,4

80,6+1,6

83,2+1,6

5 сут

461)2+5,6

475,3+5,2

474,1+4,5

468,4+4,8

16,1+0 6

11,4+),4

14,5+0 8

15,2+0,6

16,5+0,4

Il 4+0,8

14,2+0,6

12,1+0,5

14)2+0,4

Il 2+0,8

15,4+0,9

61,4+0,4

59,2+0,8

63,2+0,9

69,8+0,9

5,3+0,2

7,4+0,6

5,7+0,3

6 ° 5+Oâ8

Ф 1265215 Ь

15-17 до 5-7 сут, позволяет выделить Предложенный способ является бокишечные иерсинии при меньшей их кон- лее эффективным, чувствительным, точцентрации в исследуемом материале, ным и экономичным, чем известный, облегчает отбор колоний со среды Эн- Использование предложенного способа до с генцианвиолетом, так как они > возможно при исследовании материапов вырастают в количестве достоверно от больных, объектов внешней среды, большем, чем при использовании из- пищевых продуктов. вестного способа, 1265215

Состав ассо

100 1000 10 100

1000

10 циаций

Известный способ

Предложенный способ

16,3+0,7

62э6+О ° 3 462е3+4 ° 2

6, 5+0,4

7,2+0,2

5,1+0,4

14,2+0,9

459,6+4,8

61,9+0,4

11,5+0,7

63,2+0,4 451,3+4,1

Условия инкубации 3-5

С 1 сут

5,6+0,6

7,2+0,9

6,5+0,3

5,6+0,6

5,4+0,7

4,9+0,2

6,7+0,3

2 сут

15 3+0 6

18,6+0,3

14,5+0,8

16,5+0,3

15,4+0,7

17,5+0,4

15,4+0,6

5 сут

59,6+0,3

63,3+0,8

51,4+0,8

6 5+0 4

7,4+0,9

5,6+0,2

6,3+0,8

8,3+0,2

16,2+0,3

13,3+0,2

17,4+О, 1

14,3+0,2

18 5+0,9

54 3+0 4

58,3+0,4

Среднее количество выросших колоний при посевных дозах, клеток/мл

1265215

Среднее количество выросших колоний при посевных дозах, клеток/мл

Со с-. ассо!

0 100 !000 10 100 1000 циаций

Предложенный способ

Из ве стный спо соб!

5,6+0,7

61,4+0,8

7,6+0,5

6,5+0,4 60,4+0,7 — — 15,7+0,9

П р и м е ч а н и е. Выделенные из ассоциаций культуры .соответствуют исходным культурам иерсиний по морфологическим, культуральным, биохимическим свойствам и антигенной структуре, P

Составитель Е, Ярных

Техред Л.Сердюкова Корректор M. Самборская

Редактор Г. Волкова

Тираж 490 Подписное

ВИИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 5627/19

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Формулаизобретения

Способ выделения кишечных иерсиний путем посева исследуемого материала в среду накопления, содержащую питательную основу, воду и селективный агент, с последующим выдержива ..ием посевов при 4-6 С, пересевом и инкубированием на среде Эндо, выделением и идентификацией колоний, отличающийся тем, что, с целью ускорения способа, использу" ют среду накопления, содержащую в качестве питательной основы гидролизат рыбный сухой, а в качестве селективного агента — генцианвиолет

35 при следующем соотношении компонентов, г/л:

Гидролизат рыбный сухой 40,0-50;0

Генцианвиолет 0,005-0,02

Дистиллированная вода До 1 л, выдерживание посевов осуществляют в течение 24-48 ч, инкубирование на среде Эндо проводят в присутствии генцианвиолета в концентрации 0,0050,02 г/л в течение 1 сут, выделенные колонии дополнительно пересевают на скошенную питательную среду, содержащую агар сухой, сахарозу, рамнозу, индикатор Андреде и дистиллированную воду при следующем количественном соотношении компонентов, г/л:

Агар сухой 35,0-40,0

Сахароза 9,0-11,0

P амноза 0,9-1,1

Индикатор Андреде 38,0-42,0

Дистиллированная вода До1л идентификацию иерсиний проводят по изменению цвета среды, и при изменении окраски всей среды в розовый цвет, идентифицируют Iersinia entегоcolitica . а при окраске столбика среды — Iersinia psendotuberculosis