Способ определения мутагенной активности химических соединений

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„„Я0„„1258829 А 1 (5D 4 С 12. N 15 00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

// F

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3876043/29-14 (22) 27 ° 03.85 (46) 23,09,86. Бюл. У 35 (71) Институт экологии растений и животных Уральского научного центра

AH СССР (72) Р. А. Пшеничнов, А. А. Еремина и В. В. Сергеев (53) 575.113(088.8) (56) Anus В. N. et a1. Mutation Research,. 1975, ч. 31, р, 347, (54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МУТАГЕННОЙ АКТИВНОСТИ ХИМИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ в отношении животных и человека путем инкубации растворов химических соединений спрепаратами микросомальной фракции печени и последующим внесением в бактериальную тест-культуру, выращиваемую на селективной в отношении мутантов среде, о т л и— чающий с я тем, что, с целью повышения эффективности и точности, препарат микросомальной фракции печени предварительно иммобилиэуют на полиамидных гранулах, которые последоватeszbHO обработаны растворами соляной кислоты и глутарового альдегида.

58829 1

55

1 12

Изобретение относится к генетике, в частности к способам определения мутагенной активности химических соединений, и может быть использовано для прогноза генетических последствий загрязнения окружающей среды, для оценки потенциального мутагенного эффекта лекарственных веществ, для отбора высокоэффективных мутагенов, используемых в селекции, а также для оценки других видов биологической активности (например, бактерицидной, цитостатической, антимутагенной, радиозащитной) химических соединений.

Цель изобретения — повышение эффективности и точности способа.

Пример 1. Определение мутагенной активности циклофосфана после метаболической активации in

vitro иммобилизованной микросомальной фракцией S-9 сразу после ее получения.

Микросомальную фракцию S-9 получают центрифугированием гомогената печени кур (9000 д., 60 мин).

3 r полнамидных гранул промывают

300 мл дистиллированной воды при

60 С, инкубируют с 200 мл 3 М НС1 при той же температуре в течение 2 ч при интенсивном перемешивании на маг" нитной мешалке. Гранулы отделяют фильтрованием, промывают дистиллированной водой до рН 7,0 и инкубируют

20 ч с 200. мл.12,5Х.:ного раствора глутарового альдегида при интенсивном перемешивании на магнитной мешалке, Активированный носитель отделяют фильтрованием, промывают дистиллированной водой до отсутствия запаха глутарового альдегида и 500 мл

0,02 M К НРΠ— КН PO áóôåðà; рн 7,2. !

Отмытые гранулы ресуспендируют в

35 мл того же буфера, вносят 5 мл препарата микросом с общим содержанием белка 45 мг, инкубируют 1 ч о при +4С и осторожном перемешивании.

Вносят 16 мкл 25Х-ного водного раствора глутарового альдегида и инкубируют 60 »ин при той же температуре.

Гранулы отделяют фильтрованием, промывают 0,02 М К НРΠ— KH PO -буфеом рН » 2, IIo 10 »л 0 02 M K НРО

KH P04-6óôåðà (рН 7,2), содержащего

0 5-5 »r/ìë циклофосфана, 3,4 мг/мл

МяС1 и 1,38 мг/мп НАДФ Н, объединяют с полученными гранулами, инкубируют в течение часа при постоянном встряхивании. Гранулы отделяют раствора фильтрованием через мембранный фильтр. Полученный фильтрат объединяют с бактериальной вэвесью

Salmonella tiyhimuriums штамм ТА 1535 и вносят в чашки Петри, содержащие минимальную среду с добавлением агара до 1,5Х. Чашки Петри помещают в термостат и инкубирукт при 37 С в течение 48 ч после чего подсчитывают количество колоний. Количество мутантов увеличивается по сравнению со спонтанным в зависимости от концентрации внесенного циклофосфана в 1719 раз.

Пример 2. Определение мутагенной активности циклофосфана после метаболической активации in vitro иммобилизованной фракцией Я-100 сразу после ее получения.

Микросомальную фракцию печени кур получают центрифугированием(9000 д., 60 мин). Затем подвергают ее центрифугированию (105000 д., 60 мин), супернатант отбрасывают, а осадок ресуспендируют в 0,15 М растворе КС1, Условия получения активированного носителя и иммобилизации препарата микросом идентичны описанным в примере 1, за исключением того, что все манипуляции производят при ОУС и на иммобилизацию вносят 2 мл препарата микросом с общим содержанием белка

36 мг.

По 10 мл раствора, содержащего

0 5-5 мг/мл циклофосфана, 2,84 мг/мл

MgC1 и 1,16 мг/мл НАДФ Н, объединяют с полученными гранулами, инкубируют в течение часа при непрерывном встряхивании. Дальнейший ход определения идентичен описанному в примере 1.

Количество мутантов увеличивается по сравнению со спонтанным в зависимости от концентрации внесенного циклофосфана в 19-21 раз.

Пример 3. Определение мутагенной активности циклофосфана после метаболической активации in;, vitro повторно используемым препаратом иммобилизованной фракции S-9, хранившейся с момента первого использования в течение 7 сут при

+4 С.

Условия получения препарата и»мобилизованной фракции и тестирования активности идентичны описанным в примерах 1 и 2, за исключением того, 1258829

Составитель А. Макаров

Редактор Н. Егорова Техред М.Ходанич Корректор Т, Колб

Заказ 5087/25

Тираж 490 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 что препарат с момента получения и первого использования до повторного использования сохраняют ресуспендированным в 0,02 М К HPO - KH PO—

2 . 4 Д буфере, рН 7,2, при +4 С в течение

7 сут. Чувствительность способа определения мутагенной активности снижается на 407, но остается достаточной для обнаружения мутагенной актив5 ности циклофосфана.