Способ определения энтеротоксина сальмонелл
СОЮЗ СОВЕТСНИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ
РЕСПУБЛИН
А1 (19) (И> (5д 4 G 01 N 33/53 f68
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К Д ВТОРСКОМЪГ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР
r1O ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3868602/28-14 (22) 01.04.85 (46) 07.09.86. Бюл. 11» 33 (71) Научно-исследовательский ин. ститут морфологии человека АМН СССР (72) Ф. С. Флуер, Ю. Г. Пархоменко и И. Н. Емельяненко (53) 616.07(088.8) (56) Houston С. W., Коо F. С. W., Peterson J. W. Characterization
of SaFmoneVFa toxin reFeased by
mitomycin С-treated cells. — Infect.
Immun » 1981» 32» р 916 926 ° (54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭНТЕРОТОКСИНА САЛЬМОНЕЛЛ путем выращивания их в жидкой питательной среде с последующим лизированием бактериальных клеток, центрифугироваиием и исследованием супернатанта, о т л и— чающий ся тем, что, сцельюускорения и упрощения способа, дополнительно формалинизируют стафилококки штамма StaphiFococcus aureus Сочап I, инкубируют их с иммунной кроличьей сывороткой к термолабильному энтеро- токсину кишечной палочки, далее полученный конъюгат добавляют к испытуемому супернатанту и по интен сивности агглютинации определяют энтеротоксин сальмонелл.
1255578
Изобретение относится к медицине, а именно инфекционной патологии, и может быть использовано с эпидемиологическими целями для выявления токсикоинфекций, вызванных сальмонеллами.
Цель изобретения — упрощение и ускорение способа определения сальмонеллезного энтеротоксина с сохранением высокой специфичности и чувствительности анализа.
Выросшую микробную культуру сальмонелл подвергают лизированию любым известным способом, центр:ифугируют и исследуют супернатант в реакции коагглютинации на часовом стекле с использованием стафилококковых клеток штамма
Cowan I, содержащих белок А, соединенный с антител ами, к термолабильному энтеротоксину кишечной палочки. Данная реакция возможна вследствие иммунологического родства энтеротоксинов кишечной палочки и сальмонелл.
Способ осуществляют следующим образом.
Выполненные при профилактических осмотрах или от больных людей, а также депонированные музейные культуры сальмонелл выращивают в 10 мл любой жидкой питательной среды в пробирках объемом 40-50 мл в течение 24-30 ч при непрерывном встряхивании шуттельаппаратом при 210 об/мин и при 37 С.
Далее проводят центрифугирование при
8000 об/мин в течение 15-20 мин, недостаточную жидкость отбрасывают, к осадку микробных клеток добавляют
0,5 мл дистиллированной воды и лиэируют любым известным способом. Затем полученные лизаты .центрифугируют при 8000 об/мин в течение 1520 мин, осадок отбрасывают, а супернатант используют для,цальнейшего исследования в реакций коагглютинации.
Для проведения этой реакции готовят стафилококковый диагностикум по следующей методике.
Культуру Staphifococcus aureus
Cowan I выращивают на мясо-пептонном агаре Хоттингера (с содержанием аминного азота 180 мг %) в матрицах и смывают небольшим количеством (около 10-15 мл на 1 матрицу) 0,03 M фосфатно-солевого буфера, содержащего 0,12 М МаС1 при рН 7,3, а также аэид натрия в концентрации 0,1%.
Полученную микробную взвесь отмывают в буфере трижды. Отмытые клетки суспендируют в фосфатно-солевом буфере и готовят взвесь микробов, содержащую 50-100 млрд. микробных клеток в 1 мп по оптическому стандарту мутности, К взвеси клеток добавляют коммерческий формалин до конечной концентрации в растворе 0 5%, Формалинизирование проводят в тече10 ние 1 ч при 37 С на шуттель-аппарате (100 об/мин). Клетки отмывают от формалина трижды фосфатно-солевым буфером, а затем в том же буфере готовят 10%-ную взвесь клеток (по объему). Взвесь стабильна в течение
30 дн при 4 С.
Для сенсибилизации клеток Staphi"
fococcus aureus Cowan I с целью получения сальмонеллезного диагности15
20 кума в качестве источника специфических иммуноглобулинов используют антиэнтеротоксическую сыворотку к термолабильному энтеротоксину кишечной палочки с преципитирующим титром 1:16 и выше, не содержащую антитела к другим антигенам кишечной палочки.
Сыворотку в количестве 0,1-0,2 мя добавляют к 1 мл 10%-ной взвеси фор30
45 малинизированных клеток $t, аигеиз
Cowan I перемешивают в течение 23 мин при комнатной температуре, затем однократно отмывают суспензию от избытка антител при центрифугировании 1000 об/мин в течение 1520 мин. Осадок суспендируют в 10 мл фосфатно-солевого буфера, Реагентом в работе является взвесь стафилококков с адсорбированной на них антисывороткой, Срок хранения реагента о при 4 С не более 1-2 недель, В качестве контроля на годность использования реагента исследуют его гомогенность в капле фосфатносолеваго буфера на стекле. При отсутствии спонтанной агглютинации его используют для постановки реакции коагглютинации. При наличии спонтанной агглютинации реагент бракуют.
Для постановки опыта к 2-3 каплям реагента на часовом. или предметном стекле добавляют 1 каплю 1%-ной взвеси несенсибилизированных стафилококков. Капли на обоих стеклах размешивают осторожным покачиванием в течение 0,5-3 мин. Результаты реакции учитывают путем просмотра каРезультаты коагглютинации
Полученные из НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи
+/-/
++++ (S. enteritidis м.ч.
Депонированные в Институте стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича
+/-/
S. typhimurium 978
S ° сЬо1eraesuis 7378 пель над вогнутым зеркалом и регистрируют появление агглютинации стафилококков. Интенсивность реакции обозначается по 4-плюсовой системе, как всякая реакция агглютинации.
Образуется очень мелкий агглютинат и степень выраженности реакции определяется не столько размерами агглютинированных частиц, сколько степенью просветления жидкости в капле.
При отрицательной реакции признаков агглютинации нет, жидкость гомогенно мутна.
Пример. Исследуют согласно предлагаемому способу штаммы сальмонелл, полученные из НИИЭМ им, Н. Ф, Гамалеи, выделенные от больных, и музейные культуры сальмонелл, депонирование в Институте стандартизации и
S, Typhimurium 415
S. Typhimurium м.ч.
S. Typhimurium М
S. Typhimurium 1б
S. Typhimurium 17
S. Typhimurium 18
S. Typhimurium 19
S. Typhimurium 118
S. Typhimurium 74
S. Typhimurium 32
S. Typhimurium 33
255578 4 контроля медицинских биологических препаратов им, Л. А. Тарасевича..
Результаты исследований представлены в таблице, 5
Как видно из таблицы, международ ные эталонные штаммы сальмонелл (штамм ЯаУшопеУУа typhimurium S-23235), также как и энтеротоксигенная
t0 кишечная палочка, служащая контролем (Штамм Н-10407) дают положительную реакцию коагглютинации. Штамм К. рпеишоп1а, не продуцирующий энтеротоксин и служащий контролем, характе-. ризуется отрицательной реакцией, Интенсивность продукции энтеротоксина другими испытуемыми штаммами сальмонелл оказалась различной (от 0 до
++++), 1255578 4
Продолжение таблицы
S. heideberg 287
S, anatum ll20
S ° bredeney 210
S. ejeda 1424
S. goodvood 1471
S. ebrie 200
S. bovaire 1323
S. balboa 1886/76
S enteritidi2 27036
+++
+/-/
++++
Контроль
Фосфатный буфер
K1ebscel1a pneumonia
ST 9"19
E. colt Í-10407
Составитель Н. Хрусталева
Техред M.Ходанич Корректор М. Максимишинец
Редактор И. Дербак
Заказ 4779/26 Тираж 778 Подписное .
ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул, Проектная, 4
