Способ определения концентрации бактерий в суспензии

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„„SU„„1231077

А1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (6

4 В /7 l5

Концентрация этидиун бронида, нкй

Фйг.1

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3719309/28 !3 (22). 28.03.84

:(46) 15 .05. 86. Бюл. Ф 18 (71) Всесоюзный научно-исследова тельский институт прикладной микробиологии (72) Н. В. Косарев и Е. О. Пучков (53) 576.8(088.8) (56) Мейнелл Дж., Мейнелл. Э. Экспериментальная микробиология. М.: Мир, 1967, с. 17-38. (54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ БАКТЕРИЙ В СУСПЕНЗИИ, предус» матривающий приготовление бактериальной суспензии и регистрацию опти.ческого параметра, о т л и ч а ю— 8

М 2 ф ф

0 (58 4 С 12 0 1/00, С 12 N 1/00 //

// (С 12 Q 1/00, С 12 R 1:01) шийся тем, что, с целью повышения точности и чувствительности анализа, в суспензию вводят тритон

Х-100 до 0,03-0,05Х, этилендиамиитетраацетат-трис до 0,3-3,0 ммоль при рН 7,2-7,5, этициум бромид до

4,0-7,0 мкмоль и регистрируют прирост интенсивности флуоресценции в образцах с бактериями по сравнению с образцами без бактерий при диапазонах длин волн флуоресценции 540620 нм и диапазонах длин волн возбуждения флуоресценции 260-320 или

420-530 нм, а по величине прироста интенсивности флуоресценции делают заключение о концентрации .бактерий. Е

1231

Изобретение относится к микробиологии, в частности к медицинской микробиологии, а также микробиологической промышленности, и может быть использовано для определения количества бактерий в препаратах.

Цель изобретения — повышение точности и чувствительности анализа.

Предлагаемый способ поясняется фиг. 1-7. t0

Сущность способа заключается в приготовлении бактериальной суспен;зии в дистиллированной воде, которая вносится в раствор буфера (три -HCf, !

00 ммоль, рН 7,2-7 5), добавляются растворы тритона Х-100 (до концентрации 0,03 — 0,05X), этилеидиаминтетраацетата- триса (ЭДТАТ}, рН 7,2-7,5 (до концентрации 0,3-3,0 мИ) и этидиум бромида (2;7-диамино-10-этил- 20

-9-фенилфенантридиум бромида до кон— центрации 4-7 мкмоль). После 5-минутной инкубации измеряют интенсивность фпуоресценции этидиум бромида в суспеизии бактерий и в буфере. Разность между первой и второй величинами характеризует концентрацию бактерий в суспензии.

Способ основан на том, что флуоресцентный краситель этидиум бромид сйособен избирательно взаимодействозать с нуклеиновыми кислотами, прн этом квантовый выход его флуорес ценции увеличивается. Прирост флуоресценции красителя прямо пропорционален количеству нуклеиновых кислот. Для обеспечения проницаемости мембран грамотрицательных бактерий для флуорохрома клетки обрабатывают смесью детергента с хелатором (три- 40 тон Х-100 с этилендиаминтетраацетатом) . Регистрация прироста флуоресценции этидиум бромида при взаимодействии с нуклеиновыми кислотами однозначно отражает количество бакте- 45 рий в препарате.

Возможны два варианта количественной характеризации препаратов бактерий по флуоресценции этидиум бромида. Согласно первому строится калиб- 50 ровочиый график зависимости между приростом флуоресценции этндиум бромида в суспензии бактерий после кратных разведений и числом клеток, подсчитанных под микроскопом в счет- 55 ной камере. Второй вариант предусматривает учет количества бактерий в условных единицах прироста флуорес077 2 ценции красителя в присутствии бактерий по отношению к его флуоресценции без бактерий. Последний вариант целесообразно использовать для тех видов бактерий, количественный учет которых под микроскопом невозможен.

Пример !. В оптическую кювету последовательно вносят 3 мл буферного раствора, содержащего

100 ммоль трюс -НС1, рН 7,2, этидиум бромид до концентрации 0,1 мкмоль и измеряют интенсивность флуоресценции при 600 нм с длиной волны возбуждающего света 322 нм на спектрофлуо" риметре Перкин-Элмер, модель 1000.

Эти операции повторяют при разных концентрациях красителя. Проведенные измерения (фиг. 1) свидетельствуют о том, что для исследования фпуоресценции красителя целесообразно использовать: его концентрации, не превышающие 8 мкмоль, когда сохраняется линейная зависимость между его концентрацией и интенсивностью флуоресценции.

Пример 2. В оптическую кювету последовательно вносят 3 мл буфера, укаэанного в примере 1, этидиум бромид до концентрации бмкмоль

ЭДТАТ, рН 7,2 и регистрируют интенсивность флуоресценции, как описано в примере 1, Эту процедуру повторяют при разных концентрациях ЭДТАТ. Полученные результаты (фиг. 2) означают, что интенсивность флуоресценции этидиум бромида не зависит от концентрации ЭДТАТ в широком диапазоне.

Таким же образом исследуют влияние тритона Х-100 на флуоресценцию этидиум бромида. Результаты исследования (фиг. 3) показывают, что тритон

Х-100 при концентрациях больше,0,053 вызывает увеличение интенсивности флуоресценции этидиум бромида более чем на 5Х. Поэтому использование более высоких концентраций детергента в ходе анализа нецелесообразно.

В

< » mr Escherichia coli К-12 выращивают на глюкозо-минеральной среде до стационарной фазы роста.

Клетки осаждают центрифугированием и один раз отмывают дистиллированной водой. В оптическую кювету вносят

3 мл буфера по примеру 1 и этидиум бромид до конечной концентрации

6 мкмоль. Измеряют интенсивность флуоресценции красителя, как описано в примере 1. В ту же кювету добавля1231077 ют суспензию бактерий Е. coli до ко-. нечной концентрации, соответствующей оптической плотности образца при

600 нм 0,01 - 0 5 ед. Снова измеряют флуоресценцию. Результаты анализа показаны на фиг. 4, где a — - прий.утствие клеток в системе практически не влияет на флуоресценцию этидиум бромида, поскольку краситель не проникает через клеточную оболочку к нуклеиновым кислотам.

В оптическую кювету вносят буфер, этидиум бромид и суспенэию бактерий в указанных концентрациях, добавляют раствор ЭДТАТ до конечной концентрации 0,3 ммоль и регистрируют прирост флуоресценции красителя во времени. Анализ результатов (фиг. 4, кривая 6 ) показывает, что максимальный прирост флуоресценции красителя (максимальное связывание с нуклеиновыми кислотами) происходит через

30 мин инкубации.

В оптическую кювету вносят буфер, этидиум бромид, суспензию клеток, ЭДТАТ в указанных концентрациях, добавляют раствор тритона Х-100 до конечной концентрации 0,033 и регистрируют прирост флуоресценции красите,ля во времени, Как видно из представ ленных данных (фнг. 4, кривая 6 ), присутствие тритона Х-100 существенно ускоряет проникновение красителя в бактерии Е. coli. Тритон Х-100 без ЭДТАТ не способствует проникновению этидиум бромида в клетки Е. co.1i (фиг. 4 z ). Таким образом, именно комбинация ЭДТАТ с тритоном Х-100 способствует быстрому и полному связыванию этидиум бромида с нуклеино- выми кислотами бактерий Е. coli.

Пример 3. Культуры трех грамположительных (Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus Streptococcus facealis) и трех грамотрица<.. тельных видов (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Serratia

marcescens) бактерий выращивают на мясопептонном агаре. Клетки смывают со среды 0,15 М раствором NaCF и суспендируют. В оптическую кювету вносят

3 мл буфера трис -HCE (100 ммоль, рН 7,5), этидиум бромид (6 мкмоль) и измеряют интенсивность флуоресценции красителя по примеру I. В тот .же образец вносят суспензию одного из видов микроорганизмов в концентрации, соответствующей оптической

Таблица 1

Добавлены

ЭДТАТ и тритон

Х-100

30 Исследуемый вид Без добабактерий вок

В. subtilis

S. aureus

40 S. Заеса

Е. coli

P. aeruginosa

S, marcescens

П р и м е ч а н и е. (+) — наличие при- роста флуоресценцин; (-) — отсутствие при50 роста флуоресценции.

Пример 4. Клетки Е. coli

К-!2 выращивают на мясопептонном агаре, а также на жидких глюкозоминеральной и мясопептонной средах

55 до логарифмической и cTalu:онарной фазы роста. Бактерии, выращенные на агаре, смывают дистиллированной водой и готовят суспензию с оптической.. плотности при 600 нм не более 0,5ед. и не менее 0,1 ед. Через 5-7 мин регистрируют прирост флуоресценции красителя. Аналогичные исследования (фиг. 5) проводят после добавки в образцы ЭДТАТ (0,3 ммоль) вместе с тритоном Х-100 (0,037), полученные результаты представлены в табл. l.

Из данных табл. 1 следует, что

10 грамположительные виды бактерий свя" зывают этидиум брЪмид и беэ ЭДТАТ с тритоном Х-100. В то же время эти соединения не влияют отрицательно на связывание красителя с исследованны15 ми видами. Для грамотрицательных видов бактерий обработка ЭДТАТ с тритоном Х-100 является необходимым условием проникновения бромистого этидия к нуклеиновым кислотам. Выбранные р0 концентрации хелатора и детергента являются эффективными для всех исследованных видов. . В табл. 1 показано наличие прироста флуоресценции этидиум бромида в

25 присутствии бактерий в зависимостй от обработки хелатором с детергентом.

1231

077 ь

5 плотностью при 600 нм 0,01-0,5 ед.

Бактерии, выращенные на жидкой среде, разводят водой до такбй же оп.— тической плотности. В оптическую кювету с трис -HCE буфером (100 ммоль, рН 7,5) вносят тритон Х-100 до конечной концентрации 0,03, ЭДТАТ (рН 7,5) до конечной концентрации

1,0 ммоль, этидиум бромид до конечной концентрации 7 мкмоль. Измеряют 10 интенсивность флуоресценции, как указано в примере 1. Для дальнейших расчетов удобно уровень флуоресценции в этом образце (контрольном) принять эа О. 15

Те же соединения в такой же концентрации вносят в оптическую кювету, а затем добавляют бактериальную суспенэию и через 5 мин измеряют уровень флуоресценции. Такие опера- 20 ции проделывают с бактериальными суспензиями после кратных разведений.

Параллельно подсчитывают концентрацию бактерий в образцах под фазовоконтрастиым микроскопом в камере Го- 25 ряева. На основании полученных данных строят зависимость (фиг. 6) между приростом флуоресценции этидиум бромида (аГ) и числом бактерий в

1 мл суспензия (N). Эта зависимость 30 выражается формулой

Н=КдР, ° ° где К вЂ” соответствует тангенсу угла наклона зависимости N от ЬУ.

В полученной формуле коэффициент

К одинаков для бактерий Е . coli, выращенных на разных питательных средах и не зависит от фазы развития культуры. Минимальная концентрация бактерий Е. coli в образце, которую 40 можно определить с помощью данного метода с точностью 3-5Х, равна

10 кл/мл, что соответствует опти6 ческой плотности при 600 нм 0,001 ед.

Аналогичные измерения проводят для45

В. subtilis, S. aureus, S. saecalis, F. aeruginosa, S marcescens. Bo всех случаях прирост флуоресценции этидиум бромида линейно зависит от концентрации бактерий в образцах. 50

Пример 5. Культуру Е. coli

К-12 выращивают и подготавливают к работе как указано в примере 3. В оптическую кювету вносят 3 мл армс -HCK буфера (100 ммоль, рН 7,5), этидиум 55 бромнд (6 мкмоль), ЭДТАТ (0,3 ммоль), тритон Х-100 (О,ОЗЖ) и суспензию бактерий s концентрации 10 кл/мл. Пос8 ле 5-минутной инкубации измеряют прирост флуоресценции при 590 нм в образце по отношению к пробе, не содержащей клеток. Измерения проводят при двух длинах волн возбуждающего света (320 и 520 нм), соответствующих двум основным полосам поглощения красителя. Полученные результаты (фиг. 7) свидетельствуют о линейной зависимости прироста флуоресценции этидиум бромида от концентрации бактерий при обеих длинах волн. Это позволяет определять концентрацию бактерий при возбуждении флуоресценции этидиум бромида в обеих основных полосах поглощения.

Пример 6. Инокулят культуры

Е. coli К-12 делят на две порции.

Одну выращивают на глюкоэо-минеральной среде до логарифмической, а другую — на той же среде до стационарной фазы роста. Клетки осаждают центрифугированием и суспендируют в Н О.

С помощью камеры Горяева отдельно подсчитывают концентрацию бактерий в препаратах из логарифмической и стационарной фаз роста. Путем разведения водой доводят концентрацию бактерий в обоих препаратах до 4,6"

"10 кл/мл. В оптическую кювету вно9 сят 3 мл трис -HCE буфера (100 ммоль) и 0,1 мл суспензии бактерий из логарифмической фазы роста. Измеряют оптическую плотность суспензии при

600 нм на спектрофотометре СФ-4.

Такие же измерения проводят с бактериями из стационарной фазы роста.

В, оптическую кювету вносят 3 мл трис -НОЮ буфера (100 ммоль, рН7,5), этидиум бромид (6 мкмоль), ЭДТАТ до концентрации 0,3 мМ (рН 7,5), тритон .

Х-100 (О,ОЗЖ), 0,1 мл суспензии бактерий из логарифмической фазы роста и после 5-минутной инкубации измеряют прирост флуоресценции по сравнению с образцом без бактерий, как указано в примере 5. Такие же измерения выполняют с бактериями из стационарной фазы (данные этих измерений сведены в табл. 2).

Из данных табл, 2 следует, что бактериальные взвеси культуры

E, coli К-12 из логарифмической н стационарной фаз роста при одинаковой концентрации клеток имеют разную мутность (в табл. 2 приводятся данные в единицах оптической плотности) Таким образом, измерения одинаковой

1231077 8 стигающие 40%. В тех же условиях измерения согласно предлагаемому способу имеют расхождения не более 6%.

Таблица 2

Прирост флуоресценции зтндиум бромида (отн. ед.) Исследуемые бактерии

Е. co!i, выращенные до ста1ционарной стадии

0,184+0,005

47+2

Е. coli, выращенные до логарифмической стадии

50+2

0,272+0,005

П р и м е ч а н и е. Концентрация бактерий во всех образцах одинаковая

1, 5 ° 1О кл/мл. ся ни фаза развития культуры, ни условия выращивания бактерий, ни их . способность к агрегаЦии. Способ обла-, дает большей чувствительностью: он позволяет оценивать с точностью 3-6% концентрацию бактерий в 100 раз меньшую, чем зто позволяет делать способ по прототипу.

В табл. приведено сопоставление турбидиметрического и флуориметрического методов определения концент,рации бактерий Е. coli. 35

Предлагаемый способ определения концентрации бактерий в суспензии имеет большую точность, поскольку иа результатах анализа не сказывают40 концентрации бактерий из различных фаз развития культуры по прототипу имеют расхождения в измерении, доОптическая плотность при

600 нм (отн. ед,) 1231077 нн, нин йонаентраиим баеикри й, Ю в /не. 1 1 Ю 4 б

4енаняоажи .йиеявй, кюе/м

Составитель О, Скородумова

Техред И.Попович Корректор И, Эрдейи

Редактор Е. Копча

Заказ 2525/31 Тираж 490

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб,, д. 4/5

Подписное

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

O банеерии, Ьращенные на иного-нинераньноа фей

Ф бае ерии, йращенные на несененнмннаю фееане бают;ерии, бьващеннее на нлголентоння аеаое

Фиг 6

Ф д ц2 04 Ж М И юащвещюцве Желт, юч

1,