Способ приготовления плотной питательной среды для выращивания микроорганизмов
ООЮЭ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК (!Е (И1 gy С 12 N 1/00
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ASTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ
760 ;..
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3655786/28-13 (22) 25.10.83 (46) 23.02.86. Бюл. Р 7 (71) Институт микробиологии АН СССР и Ордена Ленина институт элементоорганических соединений им. А.Н.Несмеянова (72) В.И.Дуда, В.В.Кривенко, С.В.Рогожин, В.И.Лозинский, E.Ñ. Вайнерман, А.М.Мамцис, Л.В.Домотенко, И.И.Штильман и С.А.Иванова (53) 663.143(088.8) (56) 1. Авторское свидетельство СССР
Ф 659619, кл. С 12 N 1/20, 1977.
2. Авторское свидетельство СССР
В 514893, кл. С 12 М 1/00,. 1975. !, (54) (57) СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПЛОТНОЙ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ ВЫРАЩИ/
ВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ, предусматривающий внесение в жидкий питательный субстрат, содержащий источники углерода, азота, фосфора, минеральные соли и микроэлементы, в качестве уплотнителя поливинилового спирта с последующей стерилизацией полученной среды, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью улучшения роста микроорганизмов за счет повышения степени доступности воды в питательной среде и удешевления процесса, после стерилизации полученную питательную среду замораживают при температуре от (-5) до (-196tC в течение 0,5-24 ч,. а перед выращиванием микроорганизмов проводят ее оттаивание, при этом поливиниловый спирт используют в количестве 4-15Ж.
1213069
Изобретение относится к обшей, технической и медицинской микробиологии, касается получения плотных питательных сред для выращивания микроорганизмов различных систематических и физиологических групп и может быть использовано как в практике научно-исследовательских микробиологических лабораторий, так и в про изводственных условиях.
Цель изобретения — улучшение роста микроорганизмов за счет повышения степени доступности воды в питательной.среде.
В качестве уплотнителя среды используют гидрогель поливинилового спирта, образующийся путем замораживания исходного раствора при температуре (-5) - (-196) С в о течение 0,5-?4 ч и последующего от. таивания при соотношении компонентов в исходном растворе,Х:
Питательный
Ф субстрат (источники углербда, азота,минеральные соли, микроэлементы) 0,5-6
Поливиниловый спирт (ПВС) 4-15
Вода Остальное
При замораживании водных растворов ПВС происходит процесс криоструктурирования с образованием трехмерного каркаса гидрогеля, роль сшивок в котором выполняют участки с повышенной концентрацией водородных связей. Замораживание необходимо для ускорения процесса гелеобразования, поскольку водные растворы ПВС самопроизвольно при обычных условиях желируют крайне медленно (до. 1 мес.) .
Выбор параметров криоструктурирования при получении предлагаемых плотных питательных сред обусловлен следующим.
Концентрация ПВС ниже 4Х приводит к образованию гелей с низкими физико-механическими характеристиками и синерезису влаги, а .концентрация .выше 15Х нецелесообразна из-за большого расхода ПВС и высокой вязкости исходных растворов, затрудняющей операции перемешивания и разлива жидкой питательной среды.
Концентрация питательных субстратов — органических и минеральных веществ, находится в пределах, используемых для приготовления плотных питательных сред, на которых культивируются микроорганизмы.
При температуре криоструктурироо вания вьш(е -5 С часто наблюдаются эффекты переохлаждения растворов, а это не приводит к гелеобразованию," использование температур ниже -196 С (жидкий азот) нецелесообразно по экономическим соображениям.
Время криоструктурирования определяется как концентрацией компонентов исходного раствора, так и температурой замораживания.Для формирования плотных питательнык сред согласно предлагаемому способу требуются промежутки времени от 0,5 до 24 ч.
Плотные питательные среды для выращивания микроорганизмов готовят и используют следующим образом.
Растворяют в воде питательнуй субстрат и уплотнитель (нетоксичный ПВС), полученный раствор (если необходимо) фильтруют через пористый фильтр и стерилизуют актоклавированием в стандартных условиях, затем разливают s посуду для культивирования микроорганизмов (чашки
Петри, пробирки, колбы, микроскопические камеры и др.) н замораживают в течение определенного времени.
После оттаивания (обычно при комнатной температуре) полученные плотные питательные среды засевают известным способом (шпателем, иглой, пипеткой, в потоке зараженного воэдуха н др.) и инкубируют требуемое время в условиях, необходимых для культивирования конкретных микроорганизмов.
Рост микроорганизмов различных систематических групп на плотных питательных средах, приготовленных согласно предлагаемому способу, дан в табл. 1, тот же показатель в сравнении с базовым (агаровые среды) и известным (пленки ПВС) способами приведен в табл. 2.
Таким образом, предлагаемый способ по сравнению с известным позволяет улучшить рост микроорганизмов на плотной питательной среде (табл. 2) и расширить спектр применения среды (воэможность выращивания термофильтных микроорганизмов).
1213069
Таблица
ПитательХарактер роста и морфология колоний
Микроорганизмы
ТемпеКонратура замоцентрация
ПВС в ная среда по сравнению с агаризованными средами р ажи вания растворе, Х сред, ОС
Ф
Bacillus polymyxa
Идентичны
4,0 -5 24
10,0 -10 18
28
А
12,0 -15 18
А
Streptomyces streptomycini
8,0 -20 3
10,0 -15 18
Комплекс аэробных почвенных микроорганизмов
Б В 10 0 - 15 18
Комплекс анаэробных микроорганизмов иэ ила
Aspergillus niger
° 1
А, Г 10,0 -15 18
П р и м е ч а н и е. Среда А,X: NH401 0,033, ИнС1 2Н О 0,033
«033, КС1 0,033, пептон 0,5, микроэлементы — по Пфеннигу (11).. pH 7,2. Среда Б::Среда А с добавлением восстановителя (Na 3 9Н 0 0,057) и резазурина (0,001X).
Среда В: Среда Пфеннига (11) для сульфатвосстанавливающих бактерий. Среда Г> Сусло йо известному способу (1) .
Таблица 2
ТемпеВремя замораживаПита- Культура микроорганизмов ратура замотельный субстрат
Название
Таксономическая группа раживаНИЯ 1
С ния, ч на крио- на пленгеле ПВС ке ПВС
Спорообразую- Идентичен Нет росщая Гр(+)-бакта терия
Bacillus
polymyxa
10
: Концен трация, HBC в исходном
f растворе, Х
Время структурирования, ч
15,0 -196 0,5 Bacillus cereus
Температура инкубацни посевов, ОС
Характер роста и морфология колоний по сравнению с агариэованными средами
12130Ь9.с
Продолжение табл.2
Характер роста и морфология колоний по сравнению с агаризованными средами
Культура микроорганизмов
Время замораживаПитаТемпетель
HblA субстрат
Название
Таксономическая группа ния, ч на крио- на пленгеле ПВС ке ПВС
Еди ничные ко-196
0,5 А,Д Bacillus Спорообразуюcereus щая Гр(+)-бактерия лонии
P-формы
-15
А,Д
Нет роста
Streptomy- Актнномицет
ces streptomycini
-20
-15 18
Единич.ные колонии
10.
-15 18
Б,В Комплекс анаэробных микроорга--"низмов из ила
Единичные колонии
А,Г Aspergillus Плесневый Идентичен Слабый
niger гриб рост
-15 18
-30
Единичные колонии
Р-формы
1,5 Е
-78
Нет роста
-20 24
S taphi lococcus
aureus
Гр (+) -бактерия
-20
Saccharomyces
cereviДрожжи
Количество колоний
seae
Концентрация
ПВС s исходном растворе, X. ратура замораживаиия, С
А,Д Комплекс почвенных аэробных микроорганизмов
Escherichia Гр(-)-энтероcoli бактерия
Shigella Гр(-)-энтероflexneri бактерия идентично,размер уменьшен
1213069
Нродолжение табл.2
Культура микроорганизмов
Время заморакиваТаксономическая группа
Название ния, ч на крио- на пленгеле ПВС ке ПВС
Нет роста
Bacillus
polymyxa
Среда полужидкая,колонии
-10
А тонут
Уменьшенные размеры колоний
Гелеобраэование не происходит
12
П р и м е ч а н и е. Среда Д: мясо - пептонный бульон по известному спо- собу (1J . Среда Е: состав питательного субстрата
В и минеральных солей как для среды Хоттинира.
Составитель В. Голимбет
Редактор Н. Яцола Техред Т.Тулик
Корректор Т. Колб
Заказ 752/37 Тираж 490
ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035, Иосква, R-35, Раушская наб., д. 4/5
Подписное
Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4
Концентрация
ПВС в исходном раст- . воре, Х
Температура заморакивания, С
Питатель ный субстрат
Карактер роста и морфология колоний по сравнению с агаризованными средами
