Способ получения лизил-трнк-синтетазы

 

1.СПОСОБ ВЬЩЕЛЕНИЯ ЛИЗИЛтРНК-СИНТЕТАЗЫ из сырья животного происхождения , включающий гомогенизацию ткани, центрифугирование, диализ, хроматографию на ДЕАЕ-целлюлозе с элюцией фермента раствором КС I в буфере , о тличающийся тем, что, с целью повышения выхода фермента и упрощения способа, в качестве исходного сьфья используют мьшечную ткань кролика, которую при гомогенизации обрабатывают 4-5 мМ раствором аденозин-3-фосфорной кислоты в фосфатном буфере рН 6,9-7,1, надосадочнуга жидкость диализируют против фосфатного буфера, а при хроматографии колонку промьшают последовательно 0,02 М и 0,05-0,07 М раствором КС I в 0,025 М трис-НС1 буфере, рН 7,47 ,6, и затем элюируют целевой про (Л 1укт 0,09-0,1 М раствором КС1 в указанном трис-НС| буфере. 2.Способ по п. 1, отличающийся тем, что используют фосфатный буфер, содержащий 10 мМ KHJPO, 25 мМ КС, 5 мМ (CH-jCOO) Mg, 1,0 tM дитиотреитола, 1,0 М глицерина. со ел 3.Способ, поп, 1,отличаю05 щ и и с я тем, что используют трис со НСI буфер, содержащий 10 мМ MgCl, 0,1 мМ дитиотреитола, 2,0 М глицерина.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3745994/28-13 (22) 29,05.84 (46) 30.04.87, Бюл. N- 16 (7 1) Ордена Трудового Красного Знамени институт биохимии им, А,В.Палладина (72) M.Ô.Гулый, Л,Т.Литвиненко, Т.В.Ульяненко и P.Ä.Àíòîíåíêî (53) 577.15.07(088.8) (56) Батурина И.Д, Лизил-тРНК-синтетаза из Е.coli В: Выделение и свойства двух энзиматически активных форм.—

Украинский биохимический журнал, 1972, 44, N - 3, 338-349, С.V,Dang et al. Physiñàl and Biochemical Characterization of à Purified Arginyl-tPNA-synthetase-hysyltRNA Synthetase Complex from Rat.

hiver., "Biochem"., 1982> 21, п.8, р..1959-1966.

S.R.Dickman, D.S.Boll Differential purification of methionine

tRNa-synthetase and lysine-tRNACynthetase from rabbit liver., "В В Res. Commun.", 1977, 78 и. 4 ° р. 1191-1198. (54) (57) 1.СПОСОБ ВЬШЕЛЕНИИ ЛИЗИЛтРНК-СИНТЕТАЗЫ из сырья животного происхождения, включающий гомогенизацию

„„ У„„1195649 A D 4 С 12 N 9/00 ткани, центрифугирование, диализ, хроматографию на ДЕАЕ-целлюлозе с элюцией фермента раствором КСI в буфере, отличающийся тем, что, с целью повьппения выхода фермента и упрощения способа, в качестве исходного сырья используют мышечную ткань кролика, которую при гомогенизации обрабатывают 4-5 мМ раствором аденозин-3-фосфорной кислоты в фосфатном буфере рН 6,9-7,1, надосадочную жидкость диализируют против фосфатного буфера, а при хроматографии колонку промывают последовательно

0,02 М и 0,05-0,07 М раствором KCI в 0,025 М трис-HCI буфере, рН 7,4- Е

7,6, и затем элюируют целевой продукт О, 09-0, 1 М раствором КС1 в указанном трис-НС! буфере. С:

2. Способ по п, 1, о т л и ч аю шийся тем, что используют фос- Я фатный буфер, содержащий 10 мМ КН РО+, 25 мМ КС1, 5 мМ (СН СОО) Mg, 1,0 мМ дитиотреитола, 1,0 M глицерина, CO

3. Способ по п. 1, о т л и ч а ю- Ql шийся тем, что используют трис- ©

НС i буфер, содержащий 10 мМ MgC1» ф

0,1 мМ дитиотреитола, 2,0 М глицерина. 1;ф

1 19564

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способам получения ферментов — аминоацил-тРНКсинтетаз, которые могут найти применение в молекулярной и физико-химической биологии при изучении процессов биосинтеэа белка в тканях животных

Целью изобретения является повышение выхода фермента и упрощение спо- 10 соба.

Способ осуществляют следующим образом.

Проводят гомогенизацию животного сырья (мышечной ткани кролика), цент- 1э рифугирование, диализ, хроматографию на ДЕАЕ-целлюлозе с элюцией раствором

KCI в буфере. Мышечную ткань кролика при гомогенизации обрабатывают 4-5 мМ

АТФ, растворенной в фосфатном буфере 20 (буфер А), содержащем 10 мМ КН РО, 25 мМ КС1, 5 мМ (СН СОО) Mg 1 мМ дитиотреитола, 1,0 M глицерина, рН

6,9-7,1. Надосадочную жидкость диализируют против указанного буфера, а при хроматографии колонку промывают последовательно 0,02 M и 0,05- 0,07 M раствором КСI в 0,025 М трис-НС! буфере рН 7,4-7,6 (буфер Б), содержащем

10 мМ MgC1, 0,1 мМ дитиотреитола, 3-0

2,0 M глицерина, и элюируют целевой продукт 0,09-0,1 M раствором КС1 в указанном трис-НС I буфере.

На фиг. 1 представлена хроматограмма надосадочной (пострибосомальной) жидкости на ДЕАЕ целлюлозе, где ! — оптическая плотность (при длине волны 280 нм), которая отражает количественный выход лизил-тРНК-синтетазы 2 — удельная активность целевого 40 фермента.

На фиг, 2 представлена электрофореграмма фермента лизил-тРНК-синтетазы в полиакриламидном геле в присутствии 0,17 додецилсульфата натрия. 45 . Пример 1. 200 r измельченных мышц кролика гомогенизируют с 400 мл буфера А, в который добавляют 4 мМ

ATP. Гомогенат процеживают через ткань и центрифугируют 20 мин при 50

12 000 g. Надосадочную жидкость подвергают центрифугированию (центрифуга VAK) при 140 000 g в течение

60 мин. Полученную прозрачную пострибосомальную фракцию диалиэируют в 55 течение 18 ч против 2 л буфера А, Диализ проводят в целлофановых мешочках на магнитной мешалке. Раствор после диализа в объеме 210 мл, содержащий

9- 2

6,1 r белка с активностью rio !С-лизину 3,6 пмоль, наносят на колонку размером 35 4 см, заполненную ДЕАЕцеллюлозой (отечественного производства), которую уравновешивают буфе- „ ром Б, рН 7,4. Колонку последовательно промывают 0,02 M КСI растворенным в буфере Б (1450 мл) со скоростью

40 мл/ч, затем 0,05 M КС! в том же буфере (1500 мл) со скоростью 50мл/ч.

Затем осуществляют элюцию целевого фермента с помощью О, 1 M KC I в буфере Б, в результате чего получают фракцию в объеме 80 мл, содержащую 10 мг белка с активностью по ""С-лизину

1092 пмоль. Выход целевого фермента лизил-тРНК-синтетазы составляет 49Х со степенью очистки 303 раза.

Пример 2. 200 г измельченных мышц кролика гомогенизируют с 400 мл буфера А, рН 7,0, содержащего 4 мМ

ATP. Получение пострибосомальной (надосадочной) фракции и ее диализ осуществляют, как в примере 1, Диализат в объеме 200 мл с содержанием 6,4 r белка и удельной активностью по " С-лизину 4,6 пмоль наносят на колонку размером 4 ° 25 см, заполненную микрогранулированной Ватман ДЭ-32 ДЕАЕ-целлюлозой (Англия), уравновешенную буфером Б, рН 7,5.

Колонку промывают 1200 мл 0,02 M

KCI в буфере Б со скоростью 40 мл/ч до контрольной экстинкции (K=280 нм) меньше 0,1, затем 0,06 M KCI в вышеуказанном буфере, объем 1350 мл, со скоростью 50 мл/ч, после чего проводят элюирование целевого фермента буфером Б, содержащим О, 1 М КС!, получают фракцию в объеме 100 мл, содержащую 15 мг белка с удельной активностью по С-лизину 1390 пмоль.

Выход фермента 677, очистка 300 раэ.

Пример 3. 200 r измельченных мышц кролика гомогенизируют с 400 мл буфера А, рН 7,1, содержащего 5 MM

АТФ. Получение надосадочной,пострибосомальной жидкости и диализ осуществляют, как в примере 1, 200 мл диалиэата, содержащего

4,4 мг белка с удельной активностью по "4С-лизину 4,6 пмоль, наносят на колонку размером 4 20 см, заполненную ДЕАЕ-целлюлозой фирмы "Реанал" (Венгрия), уравновешенную буфером Б, рН 7,6. Колонку промывают 1200 мл

0,02 N KCI в буфере Б со скоростью

40 мл/ч, затем 1350 мл 0,07 M KCI в

1195649

Таблица 1

Выход, Х Гомогенность Примечание (степень очистки) Условия операции

2 мИ АТР

4 мИ ATP

5 мИ ATP

6 мИ ATP

Заявлено

300

280

280

Не влияет на повышение выхода и качество очистки при одновременном перерасходе

АТР вышеуказанном буфере. Элюирование целевого фермента осуществляют 0,09 И

КС 1 в буфере Б, получают фракцию в объеме 80 мл, содержащую 9 мг белка с удельной активностью 1280 пмоль. 5

Выход 56Х, степень очистки 280 раз.

Выбор заявленных в формуле режимов поясняется при сопоставлении выхода и гомогенности целевого фермента в зависимости от концентрации раствора

ATP (граничные и запредельные значения) при гомогенизации - в табл.1, от концентрации раствора КСi (граничные и запредельные значения) при последовательной промывке и элюции — в табл. 2.

Для проверки чистоты фермента, получаемого согласно заявляемому способу, были использованы электрофорети- 20 ческий и ферментативный методы.

Результаты проведенного электрофореза целевого фермента, полученного в примерах 1-3, в полиакриламидном геле в присутствии О, 17 додецилсульфата натрия показали, что очищенный фермент гомогенен, о чем свидетель-. ствует электрофореграмма при разных концентрациях фермента (электрофореграмма фиг. 2).

Во всех препаратах целевого фермента отсутствует активность метионил-тРНК-синтетазы, с которой наиболее вероятно образование комплекса в мышечной ткани. Инкубация фермента с избытком немеченого лизина и меченым белковым гидролизатом хлореллы не привела к включению метки, что свидетельствует об отсутствии других аминоацил-тРНК-синтетаз в полученном целевом продукте.

При использовании предлагаемого способа достигается положительный эффект, которыи по сравнению с известными методами выражается в повышении выхода конечного продукта; 50-677 целевого фермента в отличие от 5-tSX по способу-прототипу; в упрощении способа за счет уменьшения количества операций хроматографии вдвое и сокращения времени, в частности в заявляемом способе проводят 4 операции за

63-67 ч в сравнении со способом-прототипом — 10 операций за 118-128 ч или со способом-аналогом " 14 операций за 150-180 ч; s расширении источников сырья — фермент лизил-тРНК-синтетаза впервые выделен из мьппечной ткани кроликов, в получении высокоочищенного препарата со степенью очистки в 300 раз, 1195649

Таблица 2

Вьгход, %

Промывка и элюирование при хромотографии

Примечание

Гомогенность

1 промывка

Заявлено

0,02 M КС1

0,03 M KC I фермент гомогенен

50 фермент гомогенен удлиняется время промывки

II промывка 0,04 M KC1

50 фермент генен фермент гетерогенность за счет примесей небелковых венегомо0,05 М КСI

Заявлено 0,07 И КС1

67 гомогенен ществ фермент гомогенен

008МКС1

0,08 М КС I

0,09 M KCI

0,1 М KCI

0,11 С КС1

30 фермент гомогенен уменьшение выхода фермент гомогенен уменьшение выхода

Элюция

Заявлено

67 фермент гомогенен фермент гомогенен

67 гетерогенность за счет других

АРС-аз фермент гетерогенен

Редактор П. Горькова

Техред И.Попович

Корректор С.йекмар

Подписное

Заказ 1649/3

Тираж 500

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, r.Ужгород, ул.Проектная, 4