Способ определения серотонина в клетках нервной ткани на гистологическом препарате

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СЕРОТОНША В КЛЕТКАХ НЕРВНОЙ ТКАНИ НА ГИСТОЛОГИЧЕСКОМ ПРЕПАРАТЕ путем ее замораживания, приготовления срезов, высушивания к облучения световым потоком с последующим определением серотонина по интенсивности свечения , отличающийся тем, что, с целью повышения, точности способа, высушивание проводят при 40-60С в течение 10-15 мин, а для облучения используют мощность светового потока 6 -103 - 12-10.

.СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (1% (11) ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

AO ДВЛ*М ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМУ СВ ДЕТЕПЬФТВУ (2)) 3568230/28-14 (22) 24.03.83 (46) 23.11 85. Бюл. Р 43 (71) Кишиневский ордена Трудового

Красного Знамени сельскохозяйственный институт им. М. В. Фрунзе (72) 8. С. Лутан (53) 6)6-0.88.8 (088.8) (56) )0денфельд С. )О. Флоуресцентный анализ в биологии и медицине.

М.: 1965, с. 163.

Acta Univ Kundensin, 1965, ч.2,7. д) 4 С 01 Н )/30;. А 61 В 10/00. (54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СЕРОТОНИНА В КЛЕТКАХ НЕРВНОЙ ТКАНИ НА

ГИСТОЛОГИЧЕСКОМ ПРЕПАРАТЕ путем ее замораживания,.приготовления срезов, высушивания ц облучения световым потоком с последующим определением серотонина по интенсивности свечения, отличающийся тем, что, с целью повышения. точности способа, высушивание проводят при

40-60 С в течение 10-!5 мин, а для облучения используют мощность светового потока 6 )0 — 12 ° 10 .

1193ч97

Изобретение относится к медициНе

Пелью изобретения является повышение точности способа.

Способ осуществляют следующим образом, Свежую ткань замораживают в криостате и готовят из нее срезы толщиной до 25 мкм. Срезы помещают на предметные стекла, высушивают в струе теплого воздуха при чО-60 С в те0 чение 10-15 мин, и помещают под люминесцентный микроскоп, где облучают световым потоком мощностью в 61—

l2 . Сравнивают флуоресценцию иссле10 дуемых клеток с контролем, и по соотношению судят об изменении в них содержания серотонина. При этом серотонин испускает собственную флуоресценцию, достаточную для визуального наблюдения, регистрации и фотографирования. Соотношение флуоресценции различных клеток между собой и с контролем является мерой сравнительной количественной оценки изменения содержания в них серотонина. То обстоятельство, что при этом регистрируется свечение самого искомого вещества (серотонина), а не продукта его химической реакции с параформальдегидом, обеспечивает достоверность результатов и правомерность сравне— ния данных,. полученных в различных опытах и с контролем. При использовании в качестве эталонов различных концентраций серотонина возможен перевод условных единиц флоуресценции в абсолютные единицы массы вещества, Пример 1. 10 интактных крыс весом 130-150 r обезглавили в состоянии эфирного наркоза. Для исследования отобрали область четверохолмия среднего мозга, которую б заморозили в криостате при — 10 C.

Из íeå приготовили серийные срезы толщиной 15 мкм, которые установили на предметные стекла и высушили в струе теплого воздуха при 50 С в течение 15 мин.

Для выявления серотонина срезы мозга облучили светом в люминесцентном микроскопе JlONAtl-И-3. Источником света служила лампа ДРШ, при этом мощность светового потока, падающего на срез мозга, при мощности светофильтров возбуждения

ФС-1 разной толщины и апертурной диафрагмой микроскопа установили равным 310. Изучение спектральных характеристик свечения нервных клеток проводили при помощи фотометрической приставки ФМЗЛ-1А. Ею же измеряли интенсивность свечения нервных клеток. Для этого в качестве зонда испольэовали полевую диафрагму микроскопа. Из обшего значения флоуресценции нервных клеток вычитали значение неспецифической флуо-. ресценции нервной ткани. Таким образом, в расчет брали только свечение, вызванное серотонином клеток (так как исследовались группы однородных клеток, то их размер не влиял на содержание серотонина в них).

В срезах среднего мозга, в вентральных и дорэальных областях, выявили клетки, содержащие флуоресцирующую зерностость, которая занимает все тело клетки, преимущественно в местах отхождения аксона и дендритов. Ядро клетки не флуоресцирует. Зерна светятся желтым или желто25 оранжевым светом, а их количество и интенсивность свечения неодинаковы в различных клетках. В частности, в среднем мозге выявляются две группы клеток — ярко и слабо флуоресцирующие. Доказательством того„ что обнаруживаемое свечение гранул нервных клеток обусловлено именно содержащимся в них серотонином, является видимый желтый свет флуоресценции, максимум которой лежит в области 520-550 мкм. Специфическим для серотонина является также увеличение интенсивности после применения ниаламида и уменьшение после дачи животным резерпина. Дру4Î гие амины, например катехоламины, гистамин, не обладают собственной флуоресценцией и не мешают определению серотонина.

Облученные световым потоком мощ45 ностью в 310 клетки вентральных областей среднего мозга (ярко флуоресцирующие) показывают среднее свечение, равное 7,0+0,3 усл. ед./ клетку, а нейроны дорзальных областей среднего мозга (слабо флуоресцирующие) — 2,6+0,2 усл. ед./клетку, отношение яркости свечения обеих групп клеток составляет 2,6.

Пример 2 1О интактных белых лабораторных крыс обезглавили под эфирным наркозом, быстро извлекли мозг, который заморозили в криостате при температуре -1О С. Из

Таблиц а 1

Интенсивность свечения клеток, усл.ед./клетку

Мощность светового потока

А. Ярко флуоресцирующие клетки

Б. Слабо флуоресцирующие клетки

2,6+0,2

5,6+0,6

8,2+1,6

7,0+0,3

2,6

11,6+0,8

2,07

16,6+1,6

22,3+-1,2

15,1+I,l

1,92

11,0+1,2

1 21Р

2,02

10 3+0 9 тех же областей среднего мозга готовили серийные срезы толщиной

l5 мкм, которые устанавливались на предметные стекла и высушивались в струе теплого воздуха с температурой

50 С в течение 15 мин. Срезы изучались в люминесцентном микроскопе при условиях, описанных вьппе, за исключением того, что мощность светового потока устанавливалась равной 6 .

Среднее свечение ярко флуоресцирующих клеток составляет 11,6 +

+0,8 усл. ед./клетку, слабо флуоресцирующих — 6,6+0,6 усл.ед./клетку, а отношение яркости свечения обеих групп клеток равняется 2,07.

Пример 3. У 10 интактных белых лабораторных крыс получали срезы среднего мозга описанным способом, которые обрабатывали и изучали в люминесцентном микроскопе при условиях, приведенных в примере I за исключением того, что мощность светового потока устанавливалась равной 9 . При таком освещении сильно фпуоресцирующие клетки среднего мозга показывали свечение, равное

6,16+1,6 усл. ед./клетку, слабо флуоресцирующие - 8,2+1,6 усл.ед,/ клетку, а отношение свечения обеих групп клеток равнялось 1,92.

Пример 4 . У. 10 интактных лабораторных крыс получали описанКак видно из табл. 1, слабо флуоресцирующие клетки среднего мозга могут быть выявлены только при применении мощности светового пото193497 4

\ ным способом срезы среднего мозга, которые обрабатывали и изучали в люминесцентном микроскопе при условиях, приведенных в примере 1, за исключением того, что мощность облучающего светового потока устанавлию валась равной 12 . При такой мощности светового потока сильно флуоресцирующие клетки показывают

10 среднее свечение, равное 22,3+

+1,2 усл. ед./клетку; слабо флуоресцирующие — 11,0+1,2 усл.ед/клетку, а отношение свечения обеих групп клеток равно 2,02.

15 Пример 5. Срезы среднего мозга 10 интактных белых лабораторных крыс получали, обрабатывали и изучали в люминесцентиом микроскопе при условиях, описанных в примере 1, за исключением того, что мощность облучающего светового потока устанавливалась равной 14 .

В таком световом потоке сильно флуоресцирующие клетки показывали свечение 15,1+1,1 усл.ед./клетку, слабо флуоресцирующие — 10,3+0,9 усл.ед/ клетку, соотношение между свечением обеих групп клеток. составляло 1,5.

Интенсивность свечения серотонинсодержащих клеток среднего мозга при облучении ик светом различной силы приведена в табл . 1.

55 ка не слабее 3". Световой поток мощностью менее 3 " не выявляет все серотонинсодержащие клетки мозга и не может применяться для их ана5 11 лиза. С увеличением мощности светового потока интенсивность флуоресценции обеих групп клеток мозга воз. растает, однако. только в интервале от б"о до 12" интенсивность флуоресценции возрастает линейно в зависимости от мощности светового потока.

В этом интервале соотношение флуоресценции двух групп клеток, содержащих различное количество серотонина, сохраняется равным приблизительно двум.

Поток света мощностью более 12 например 14, уменьшает флуоресцен1о цию из-за усиленного разрушения серотонина светом, и не может применяться для его анализа. Следовательно, для анализа серотонинсодержащих клеток может применяться световой поток мощностью от 3"о до 12

Пример 6. Срезы среднего" мозга получали от 10 белых интактных крыс способом, описанным в примере l. Срезы устанавливались:на предметные стекла и высушивались в струе воздуха с. температурой 20, 40, 50, 60 и 80 С. Исследования показали, что высушивание срезов при 20 С требует больше времени, чем при использовании воздуха с температурой 50 С.

Изменение сроков высушивания является нежелательным, так как при этом в нервных клетках происходят определенные химические превращения, влияющие на содержание в них серотонина. Поэтому такая температура не может применяться для анализа серото93497 Ь

Пример 8. Сравнение точности известного и предлагаемого способа исследования серотонина. Мозг 10 белых лабораторных интактных крыс замораживали в криостате при темпе5 о ратуре -10 С и из области дорзального ядра шва среднего мозга готовили серийные срезы толщиной 20 мкм.

Срезы нумеровались от 1 до 20 и

lO наклеивались на отдельные предметные стекла. Таким образом, каждый срез содержал клетки одной популяции— дорзального ядра шва с одинаковым содержанием в них серотонина. В

15 дальнейшем 10 срезов обрабатывали существующим гистохимическим методом .выявления серотонина, а 10 среэов— предлагаемым способом. Это дает возможность выявить влияние условий реакции на результаты определения серотонина. На конечном этапе во всех срезах определяли интенсивность свечения серотонинсодержащих клеток, как описано в примере 3.

Полученные результаты обрабатывали статистически с вычислением средней арифметической (М), среднеквадратического отклонения (4 ), дисперсионного отношения (Уц) и критических значений параметра для уровней значимости Q 0,01 и 0 0,05 по таблицам Фишера.

Интенсивность свечения серотонинсодержащих клеток в срезах мозга, обработанных предлагаемым способом (нечетные номера) и известным (четные номера) приведена в табл. 2.

Таблица 2

Срезы, 40

Срезы

Интенсивность флуоресценции (усл.ед.) Интенсивность флуоресценции (усл. единицы) 1 2.

25,3

16,0

16,0

17,2

24,2

15,3

19,1

17,1

18,3

14,2

22,1 нина.

Температура 80 С вызывает денао турацию нервных клеток, искажение их структуры, и поэтому такое значение температуры также не может применяться для анализа серотонина. Следовательно, оптимальным является

4 высушиванием срезов воздухом с температурой 40-60 С.

Пример 7. Срезы среднего мозга 10 интактных белых крыс .полу- чали, как описано в примере l. Срезы устанавливались на предметное стекло и высушивались в струе воздуха с температурой 50 С в течение

5,10,15 и 25 мин. Исследования показали, что полное высушивание срезов наступает через !5 мин. Высушивание в течение 5 мин не обеспечивает пол-, ного обезвоживания срезов, а 25 мин являются избыточными.

7 1193497

Продолжение табл.2 нит ельного количества определения серотонина в клетках и оценки изменения его содержания при различных болезнях по сравнению с контрольными, здоровыми животными, изучена на крысах с различным уровнем серотонина в клетках, вызыванным резерпином и ниаламидом. В качестве контроля использованы здоровые ин10 тактные крысы с нормальным содержанием серотонина в клетках мозга.

Так как резерпин приводит к исчезновению серотонина в слабо флуоресцирующих клетках, то в этих опытах

15 изучались только ярко флуоресцирую щие серотонинсодержащие клетки. уровень амина в которых лишь значительно снижается резерпином.

Мозг интактиых крыс, а также жи20 вотных, получивших реэерпин и ниа ламид, извлекался после декапиляции животных, замораживался в криостате

O при температуре — 10 С, и изготавливали срезы толщиной 15 мкм. Последние устанавливали на предметные стекла и высушивали в струе воздуха, с темгературой 50 С в течение 15 мин.

Содержание серотонина в нейронах наследовали в люминесцентном микроскопе, как описано в примере 1, при мощности светового потока 9

1Ь

Интенсивность флуоресценции серотонинсодержащих клеток в зависимости от содержания серотонина представлена в табл. 3

14 17,6

15,8

15

16 . 20,5

16,4

18 19,7

16,1

15,9

20 17,2

M 16,07

М 20,0

0,49

8,4

Так как дисперсионное отношение (р„17,1)больше критических значений параметра по таблице Фишера (5, 37 и 2,7), то различие в дисперсии рядов является существенным и определяется недостаточной точ- ЗО ностью известного метода определения серотонина по сравнению с предлаг аемым.

Пример 9. Возможность применения данного способа для сравТаблица 3, Крысы, получившие ниаКрысы, получившие резерпин

Интак тные крысы (контроль) Показатели ламид

Интенсивность свечения, усл.ед./клетку

22,3+1,2 13,99+0,76 50,88+5,3

Отношение к контролю, Х

62,7

228,1

0,01

0,01

0,01

Примечание. Приведенные в табл. 2 значения интенсивности флуоресценции серотонинсодержащих клетокпредставляют собой среднийрезультат измерения 15 клеток в каждом срезе.

Полученные данные показывают, что предлагаемый способ пригоден для. сравнительного количества определения серотонинав клетках, так как улавливают сдвиги в содержании вещества,вызванные фармакологическимипрепаратами.

1193497

Составитель В. Головин

Редактор П. Коссей Техред О.Неце Корректор Е. Рошко

Заказ 7306/43 . Тираж 896 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Использование данного способа обеспечивает по сравнению с известными большую точность определения сдвигов в содержании серотонина в клетке,. так как за основу берется собственная флуоресценция серотонина, а не продукта его химической .конденсации с параформальдегидом, при этом точность определения повышается на 10-15Х.