Способ определения жизнеспособности яиц гельминтов

 

1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ ЯИЦ ГЕЛЬМИНТОВ , заключающийся в прокрашивании их в водной среде красителем с последуюш,им микроскопированием и подсчитыванием, отличающийся тем, что, с целью повышения точности определения, яйца гельминтов предварительно охлаждают до 4-6°С, подсушивают , после чего заливают средой, содержащей 96%-ный этанол, краситель и 0,05 гр«с-НС1 буфер в соотношении

„„31.1 „„1082402

СОЮЗ СОВЕТСНИХ СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН з(д) А 61 В 10/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А BTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

00 ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3491322/28-13 (22) 14.09.82 (46) 30.03,84. Бюл. № 12 (72) С, М. Герман и С. А. Беэр (71) Ордена Трудового Красного Знамени институт медицинской паразитологии и тропической медицины им. Е. И. Марциновского (53) 615.777/779 (088.8) (56) 1. Авторское свидетельство СССР № 550156, кл. А 61. В 10/00, 1975.

2. Дроздов В. Н. Выживаемость яиц

Opisthorchis felineus (Rivolta, 1884) в различных условиях внешней среды.-«Медицинская паразитология и паразитарные болезни». М., Медгиз., № 3, 1962, с. 323-326. (54) (57) 1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ

)КИЗНЕСПОСОБНОСТИ ЯИЦ ГЕЛЬМИНТОВ, заключающийся в прокрашивании их в водной среде красителем с последующим микроскопированием и подсчитыванием, отличающийся тем, что, с целью повышения точности определения, яйца гельминтов предварительно охлаждают до 4 — 6 С, подсушивают, после чего заливают средой, содержащей 96О/о-ный этанол, краситель и

0,05 трис-HCl буфер в соотношении (9 — 12):

: (1 — 10): (78 — 90) при рН 8,5 — 9,5, далее нанесенные на предметное стекло яйца гельминтов в той же среде перед микроскопированием покачивают и жизнеспособность определяют по числу вышедших мирацидиев.

2.: Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве красителя берут сафранин или фуксин. е с2

1082402

Изобретение относится к медицине, в частности к паразитологии.

Известен способ определения жизнеспособности личинок гельминтов, заключающийся в том, что при определении жизнеспособности адолескариев парамфистоматид последние помещают в 0,4 — 0,6 /0-ный раствор сернистого натрия, приготовленного на 0,5 — 0,85О/р-ном растворе NaC1, и жизнеспособными считают адолескариев, из которых эксцистировались личинки парамфистоматид {1).

Известный способ не позволяет определять жизнеспособность яиц трематод.

Наиболее близким к предлагаемому является способ определения жизнеспособности яиц гельминтов, основанный на замещении красителей и заключающийся в том, что яйца гельминта вначале подвергают окрашиванию бриллианткрезилблау, а затем сафранином. При этом происходит замещение красителей и живые яйца приобретают 20 красную окраску, а неживые становятся двухцветными: скорлупки красные, содержимое яйца-синее (2).

Недостатком данного способа является низкя точность идентификации жизнеспособных яиц, так как определение проводится косвенным методом на основании плохо выраженных различий в окраске живых и погибших яиц, к тому же эта разница в окрашивании исчезает через 30 — 40 мин:

Цель изобретения — повышение точности определения.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения жизнеспособности яиц гельминтов, заключающемся в прокрашивании их в водной среде красителем с последующим микроскопированием 35 и подсчитыванием, яйца гельминтов предварительно охлаждают до 4 — 6 С, подсушивают, после чего заливают средой, содержащей 96О/ll-ный этанол, краситель и

0,05 трис-НС1 буфер в соотношении (9-12): 4О

: (1 — 10): (78 — 90) при рН 8,5 — 9,5, далее нанесенные на предметное стекло яйца гельминтов в той же среде перед микроскопированием покачивают и жизнеспособность определяют по числу вышедших мирацидиев.

4S

При этом в качестве красителя берут сафранин или фуксин.

Способ осуществляют следующим образом. Предварительно охлажденные до 4—

6 С и слегка подсушенные с помощью полоски фильтровальной бумаги яйца тре- 0 матод (описторхисов, клонорхисов) заливают в центрифужной пробирке средой комнатной температуры, содержащей, ч.:

96О/ц-ный этанол 9-12

Краситель (маточный раствор) 1 — 10

0,05р трис-НС1 буфер (рН 8,5 — 9 5) 78 — 90

Пробирку слегка встряхивают, затем

0,1 мл (1 — 2 капли) среды со взвешенными яйцами переносят на предметное стекло и оставляют на 5 — 10 мин. Предметное стекло с каплей при этом необходимо слегка покачивать для создания слабых токов жидкости.

Затем добавляют еще О,! мл среды и осторожно накрывают нокровным стеклом. Препарат просматривают под обычным световым микроскопом при 20-кратном увеличении. Жизнеспособность определяют по числу вышедших из яиц мирацидиев.

Пример 1. Среду готовят из 9 ч. 96 /О-ного этанола, 1 ч насыщенного спиртового раствора фуксина, остальное (до 100 ч) 0,05/и трис-HCl буфер, рН 9,5.

Определение жизнеспособности яиц.

Взвесь яиц в воде предварительно охлаждают в холодильнике до + 4 С. В центрифужную пробирку пипеткой вносят 1 каплю взвеси, содержащей 100 — 500 яиц (меньшее их число может дать нерепрезентативные результаты, а большее затруднят подсчет).

Пробирку со взвесью яиц ставят в штатив на 3 — 5 мин для того, чтобы яйца опустились на дно. Полоской фильтровальной бумаги, опущенной в пробирку, осторожно отсасывают излишки воды и пастеровской пипеткой в пробирку с подсушенными таким образом яйцами добавляют 0,1 мл среды, встряхивают, пипеткой переносят на предметное стекло и оставляют на 10 мин, слегка покачивая. Затем добавляют еще 0,1 мл среды и осторожно накрывают noKpoBHbllvi стеклом.

Препарат просматривают под обычным световым микроскопом -ри 20-кратном увеличении. Перечисленные операции занимают

20 — 25 мин, вместе с подсчетом вышедших мирацидиев 30 — 40 мин.

Пример 2. Среду готовят из 12 ч 96О/цного этанола, 10 ч маточного раствора сафранина (5 мг в 10 мл дистиллированной воды), остальное (до 100 ч) 0,05p трис-НС1 буфер, рН 9,5.

Определение жизнеспособности яиц проводят как в примере 1, но взвесь яиц в воде предварительно охлаждают до + 6 С.

Пример 3. Среду готовят из 11 ч 96О/оного этанола, 5 ч маточного раствора сафранина (5 мг в 10 мл дистиллированной воды), остальное (до 100 ч.) 0,05 р трис-НС! буфер, рН 9,0.

Определение жизнеспособности проводят как в примерах 1 и 2, но взвесь яиц в воде предварительно охлаждают до + 5 С.

Испытание метода проводили на яйцах описторхисов (Opisthorchis felineus) и клонорхисов (Clonorchis sinensis), полученных из гельминтов при вскрытии спонтанно инвазированных кошек из очагов описторхоза (в Томской и Сумской областях) и клонорхоза (Хабаровский край) и экспериментально зараженных лабораторных жи1082402

52,0-+21,3

75,0- 12,0

10-20 дней

19 мес.

75, 0" 1, 2

12,8 0,7

Составитель В. Фролова

Редактор А. Мотыль Техред И. Верес Корректор О. Билак

Заказ 1603/3 Тираж 688 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и от крытий

1 l 3035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП «Патент>, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 вотных (золотистых хомяков) . Полученные таким образом яйца гельминтов в различное время (от нескольких часов до двух лет) и при различной температуре (от 0 до 25 С) содержались в воде.

Предлагаемый способ определения жизнеспособности яиц гельминтов (трем атод, у которых выход личинок из яиц в естественных условиях происходит в организме промежуточного хозяина — пресноводного моллюска) основан на физико-химической активации железы вылупления мирацидия и стимулирования его двигательной активности, что приводит к активному выходу мирацидиев из яиц в экспериментальных условиях.

Выход мирацидиев осуществляется при действии на яйца гельминтов среды в сочетании с рядом обязательных последовательных приемов: созданием перепада температур, подсушиванием взвеси яиц, созданием слабого тока жидкости в исследуемой капле. Основная функция среды — химическая активация железы вылупления мирацидиев. Все составные части среды подобраны экспериментально, изменение их соотношений сверх данных пределов ведет к резкому снижению выхода личинок. Добавляемый в среду краситель не несет основной функции в определении жизнеспособности яиц, а лишь облегчает нахождение и подсчет вышедших мирацидиев, поэтому можно использовать любой краситель, работающий в пределах рН 8,5 — 9,5, в частности взят.сафранин и фуксин.

Предварительное охлаждение взвеси яиц до 4 — 6 С (как и другие указанные физические воздействия) дополнительно стимулирует активность железы вылупления мирацидия. Охлаждение яиц до температуры ниже + 4 С вызывает длительное торможение активности железы вылупления, что ведет к прекращению выхода личинок.

В таблице приведены результаты определения жизнеспособности яиц описторхисов, определенные известным и предлагаемым способами.

Более высокая точность определения по предлагаемому способу подтверждается

20 резким снижением статистической ошибки получаемых результатов. Кроме того, процент жизнеспособных яиц после 9 мес. хранения, определенный предлагаемым способом, соответствует норме, в то время как определенный известным способом оказывается резко завышенным вследствие прокрашивания пустых скорлупок как живых объектов.