Способ определения миграционной способности лейкоцитов периферической крови

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИГРАЦИОННОЙ СПОСОБНОСТИ ЛЕЙКОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ путем инкубации их в агаре, содержащем сыворотку человека с последующей окраской зон миграции и опр|вделением их площади, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, инкубацию лейкоцитов осуществляют в агаре, содержащем 0,8-1,2% сыворотки .

„.Я0„„, 1076090 А

СОЮЗ COBETGHHX

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

3(51) A В,10 00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3443674/28-13 (22) 21.05.82 (46) 28.02.84. Бюл. 9 8 (72) И. Б. Каргина, С.Н.Москвина н В. Я.Арион (71) 2-й Московский ордена Ленина государственный медицинский институт . им. Н.И. Пирогова (53) 615. 3.75 (088.8) (56) 1. Лимфоциты, выделение, фракционирование и характеристика ° М., Медицина, 1980, 264.

2. Денисов В.Н. Агармиграционный тест для исследования фактора, ингибируЮщего пбдвижность лейкоцитов.— Лабораторное дело, 1981, Р 6, 359-362. (54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИГРАЦИОННОЙ СПОСОБНОСТИ ЛЕЙКОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ путем инкубации их в агаре, содержащем сыворотку человека с последующей окраской зон миграции и определением их площади, отличающийся тем, что, с целью повыаения точности способа, инкубацию лейкоцитов осуществляют в агаре, содержащем 0,8-1,2% сыворот ки.

1076090

Изобретение относится к медицине, точнее к клинической иммунологии, касается оценки состояния клеточноопосредованного иммунитета у человека и может найти применение в изучении иммунопатологий человека, например, при инфекционных заболеваниях, при аутоиммунных расстройствах, после транспланции органов,при опухо левых заболеваниях, при контактной гиперчувствительности и при иммунодефицитах, а также в исследовании иммунобиологии лимфоцитов и клетрчных взаимодействий, связанных с иммунным ответом.

Известен способ определения миг- 15 рационной способности лейкоцитов в капилляре (13.

Однако данный способ трудоемок в исполнении, а кроме того, нестандартность капилляров, адсорбция клеток на стекле приводит к снижению чувствительности способа.

Известен также способ определения миграционной способности лейкоцитов в агаре (2). 25

Однако известный способ недостаточно точен, так как зоны миграции имеют рыхлые, трудно определяемые границы.

Цель изобретения — повышение точ30 ности способа.

Указ анная цель достигается тем, что при осуществлении способа определения миграционной способности лейкоцитов путем инкубации их в агаре, содержащем сыворотку человека с последующей окраской зон миграции и определением их площади, инкубацию лейкоцитов осуществляют в агаре, содержащем 0,8-1,2Ъ сыворотки.

Способ осуществляют следующим образом.

1..Приготовление агара.

П 3,0 г агара Дифко сме шивают с 97 мл 0,05 М таис -НС1 буфе- 45 ра рН 7,3, содержащего 0,9Ъ NaCl.

Смесь выдерживают 15 мин при комнатной температуре, а затем нагревают на водяной бане до образования светлого гомогенного раствора. Готовый 5()

ЗЪ-ный агар разливают в стерильные пробирки по 5 мп и помещают в холо-. дильник (14 С), где он хранится до момента использования.

2. Приготовление агаровых блоков с содержанием сыворотки 1,5Ъ.

4,85 мл среды 199 смешивают с

0,15 мл телячьей сыворотки и с

15 мкл раствора мономицина с исходной концентрацией 1,1 г/мл. Получен- 60 ную смесь объемом 5,015 мл нагревают до 52 С и смешивают с 5 мл расплавленного на водяной бане и охлажлажденного до 51 С раствора ЗЪ-ного о агара, быстро перемешивают и сразу 65 же разливают по 1 мл в платиковые камеры диаметром 2 см. После застывания агара камеры перевертывают гелем вверх и ставят в эксикатор, где создают влажную атмосферу с 5%-ным содержанием СО2, Эксикатор помещают в холодильник (+4 С) .

3. Приготовление агаровых блоков с содержанием сыворотки 1Ъ.

9,85 мл среды 199 смешивают с

0,15 мл телячьей сыворотки и с

20 мкл раствора мономицина с исходной концентрацией 0,1 г/мл. Полученную смесь объемом 10,02 мл нагревают до 52 С и смешивают с 5 мл расплавленного на водяной бане и охлажденного до 51. С раствора ЗЪ-ного araра,быстро перемешивают и сразу же разливают по 1 мя в пластиковые камеры диаметром 2 см. После застывания агара камеры перевертывают гелем вверх и ставят в эксикатор, где создают влажную атмосферу с 5%-ным содержанием СО . Эксикатор помещают в холодильник (+4 С) .

4. Приготовление суспензии лейкоцитов.

Испытание проводят на свежей крови одного донора, собранной в объеме

10 мл в пробирку с консервантом гепаринов. Пока готовят агаровые блоки с концентрацией сыворотки 1,5 и

1,0Ъ,пробирка с кровью стоит при комнатной температуре 45 мин. За это время эритроциты оседают, плазму, обогащенную лейкоцитами, отбирают и отцентрифугируют при 1000 об/мин

5 мин. Осадок, содержащий лейкоциты, трижды отмывают средой 199 при тех же условиях. Осадок лейкоцитов после заключительнoro отмывания ресуспендируют в среде 199, подсчитывают концентрацию клеток и доводят ее до концентрации 3,5 10 8 /мл. Получают суспензию лейкоцитов объемом

80 мкл с концентрацией 3,5 108в

5, Постановка реакции миграции лейкоцитов.

В охлажденных агаровых блоках с концентрацией сыворотки 1,5 и 1,0% пробойником диаметром 2, 5 мм делают лунки. Смешивают 30 мкл рабочей суспензии клеток с 30 мкл среды 199 и из этой смеси вносят в 3 лунки агаровых блоков с концентрацией сыворотки 1,0Ъ и в 3 лунки агаровых блоков с концентрацией сыворотки

1,5% по 10 мкл смеси в каждую лунку. Эти лунки контрольные, в них оценивают миграцию лейкоцитов без антигена. В другой пробирке смешивают 30 мкл рабочей суспензии клеток и 30 мкл раствора препарата антигена, полученного из удаленных при тонзилэктомии миндалин. Из этой смеси вносят в 3 лунки агаровых блоков

1076090 с концентрацией сыворотки 1,5% и в

3 лунки агаровых блоков с концентрацией сыворотки 1,0% по 10 мкл смеси в каждую лунку. Все агаровые блоки ,помещают в эксикатор с влажной атмосферой, содержащей 5Ъ СО2 . Эксикатор 5 с агаровыми блоками помещают в термостат при 37 С.

6. Оценка результатов миграции. На следующий день после 17 ч инкубации при 37 С агаровые блоки вынимают из эксикатора, заливают . 10%-ным раствором формалина на 1 ч для фиксирования клеток. Затем формалин сливают, гели подсушивают в потоке воздуха до исчезновения следов влаги в лунках и удаляют гель из камер при помощи скальпеля. Размеры зон миграции оценивают планиметрически с помощью аппарата Микрофот тип

5ПО-1 . Каждую 3oHy MHrpagHv внсимо снимают 4 человека .одинаковой

20 квалификации. После этого эоны миграции окрашивают О, 2Ъ-ным водным раствором красителя трипановый синий и те же 4 человека определяют размеры тех же зон миграции, но уже после окрашивания. Для расчета индекса миграции (ИМ) используют формулу

ИМ Площадь кРуга опыта

Плоь,адь круга контроля 30

ИМ=(РаДиУс зoHbl в QllblTe)

2 или ИМ= (Радиус зоны в контроле)2 ( 100 б

П р н м е р 1. 5 мл 3%-ного агара Дифко -, приготовленного по прототипу на 0,05»Рис -НС1 буфере рН 7,3, содержащем 0,94 NaC1, в день опыта расплавляют, остужают 40 до 50-54ОС и смешивают с нагретыми до той же температуры 8,5 мп среды

199, содержащей 30000 ед мономицина, и с 1,5 мл сыворотки человека 1у группы -Смесь быстро перемешивают 45 и сразу же разливают в ru атиковые камеры диаметром 2 см по 1 мл полученного 1Ъ агара концентрацией сыворотки 10%. Высота агара в камерах

3 мм. После застывания агара камеры переворачивают вверх дном и ставят в эксикатор с 5Ъ-ным содержанием

СО . Эксикатор помещают в холодную камеру (14 С).

Эксперимент проводят на свежей 5 5 крови одного донора, собранной в про. бирку с консервантом гепаринов.

Кровь выдерживают при комнатной температуре 30-40 мин, чтобы осели эритроциты. Плазму, содержащую лейкоци- 60 ты отбирают и центрифугируют при

1 о

1000 об/мин 5 мин при 4 С.Осадок, содержащий лейкоциты, трижды отмыва-ют средой 199. Осадок лейкоцитов после заключительной отмывки ресус- 65 пендируют в среде 199, подсчитывают концентрацию клеток и доводят ее до 3 10 клеток/мл.

В охлажденных агаровых блоках про бойником диаметром 2,5 мм делают лунки. В каждую лунку вносят по

10 мкл рабочей суспензии клеток, полученной путем предварительного смешивания равных объемов исходной клеточной суспензии со средой 199 (контроль) или с раствором антигена (опыт) . После этого агаровые блоки помещают в эксикатор с влажной атмосферой, содержащей 5% CO ° Инкубацию проводят при 37 С 18-20 ч.

На следующий день агаровые блоки заливают 10%-ным раствором формалина, выдерживают 1 ч и после удаления слоя геля оценивают величину эоны миграции планиметрически при помощи аппарата Микрофот тип 5ПО-1 . Каждую зону миграции независимо снимают

4 человека одинаковой квалификации .

Полученные результаты представлены в табл. 1 (в табл. 1-8 R — радиус зоны миграции в контроле; R — радиус зоны миграции в опыте (с антигеном); ИМ вЂ” индекс миграции, опредецяемый по формуле И М= " 100% ii

{ о)

{й„)

1, 2, 3, 4 — номера экспериментаторон, снимавших эоны. миграции ) .

Пример 2. Все процедуры выполняют, как в примере 1, за исключением того, что используют агаровые блоки с концентрацией сыворотки 1,5В, Полученные результаты приведены в табл. 2.

Пример 3. Все процедуры выполняют,как в примере 1, за исключением того, что используют агаровые блоки с концентрацией сыворотки

1,294.

Полученные результаты приведены в табл. 3.

Пример 4. Все процедуры выполняют.,как в примере 1, за исключением того, что используют агаровые блоки с концентрацией сыворотки 1,0t

Полученные результаты приведены в табл. 4.

Пример 5. Все процедуры выполняют,как в примере 1, за исключением того, что используют агаровые блоки с концентрацией сыворотки 0,8%

Полученные результаты приведены. в табл,. 5 .

H р и м е р б. Все процедуры выполняют, как в примере 1, за исключением того, что используют агаровые блоки с концентрацией сыворотки 0,5%

Полученные результаты приведены в табл. 6.

Пример 7. Все процедуры выполняют, как в примере 2, за исклю1076090

Таблица 1

Значение индекса миграции 1,HM )лейкоцитов периферической крови при использовании агаровых блоков коицентрацией сыворотки 10%

3 4 Интервал,Разброс Среднее

I значение

Вк 3 9 Зi68 Зi42 Зi59 Зi42 3 9 Оi48 3 647 0 24

4 6 3 40 Зг58 4юОО 3,г40 4к6 l,ю2 Зг895+Oк6

ИМ % 139,5 95,2 110 124 95,2-139,5 /44,3 117,2+22,15

Т а блица 2

Значение ИМ лейкоцитов периферической крови при использовании агаровых блоков с концентрацией сыворотки 1,5%

Разброс Среднее значение

Интервал

R 3,85 3,80 3,73 3,38 3,38-3,85 0,47 3,69+0,235

Во 3 9 4,18 3 28 3 72 3 28 4 18 0 9 3 77+0 45

33, 5 108+16, 75

ИМ% 102,5 121 87,5 121 87,5-121 чением того, что после снятия размеров эон миграции последние окрашивают 0,2%-ным воцным раствором трипановой сини и те же 4 человека определяют размеры тех же зон миграции, но уже после окрашивания.

Результаты приведены в табл. 7.

Пример 8. Все процедуры выполняют, как в примере 4, за исключением того, что после сйятия размеров эон миграции последние окрашивают 0,2%-ным водным раствором трипановой сини и те же 4 человека определяют размеры тех же эон миграции но уже после скрашивания.

Результаты приведены в табл. 8..

При сравнении данных, приведенных в табл. 1-6, видно, что при использовании агаровых блоков с концентрацией сыворотки более 1,5% разброс в значениях индексов миграции, полученных 4 различными людьми одинаковой квалификациьь при снятии одной и той же зоны миграции, очень велик и составляет 44,3%. Если максимально допустимый разброс в значении ИМ составляет 10% то такие большие отклонения, как 44% (при концентрации сыворотки в агаровых блоках 10%) могут приводить к неправильной оценке иммунореактивности обследуемого пациента. Действительно, при истинном значении ИМ, близком к норме, т.е. к 100%, экспериментатор с равной вероятностью может получить значение ИМ как мень5 ше 100% т.е. ингибирование, так и больше 100%, т.е. отсутствие ингибирования. В первом случае это .будет указывать на плохое состояние пациента и на необходимость проведе10 ния специфической терапии, а во втором — на удовлетворительное состояние пациента, когда специфическое лечение может быть и не показано.

Как видно из данных, представленных в табл. 7 и 8, предлагаемая окраска зон миграции 0,2%-ным водным раствором красителя трипановая синь снижает ошибку в определении размеров зон миграции с 8% (табл. 4, 0 агаровые блоки с концентрацией сыворотки 1,0% без окраски) до 2,5% (табл. 8, агаровые блоки с концентрацией сыворотки 1,0%, с окраской) .

Таким образом, использование пред25 лагаемого способа определения миграционной способноСти лейкоцитов периферической крови обеспечивает по сравнению с известными повышение точности с 44,3 до 2,5% и экономию средств за счет. уменьшения концентрации сыворотки в агаровых блоках в

10 раз (с 10 до l, 2-0, 8%) .

107.6090

Таблица 3

Значение ИМ лейкоцитов периферической крови при использовании агаровых блоков с концентрацией сыворотки 1,2%

4 Интервал Разброс Среднее значение

R 3, 37 3, 3 3, 42 3, 4 3, 3-3, 42 О, 12 3, 37+0 06

Rî 3, 7 3, 38 3, 58 3, 6 3, 38-3, 7 0 32 3,56+0, 16

ИМ,% 120 . 105 109, 5 112 105-120

ill 6+7 5

Таблица 4

Значение ИМ лейкоцитов периферической крови.при использовании агарных блоков с концентрацией сыворотки l 0%

3 4 Интервал Разброс Среднее значение

R 33:3 3,32 3,25 3,32 3,25-3,32 0,07 3,2910,035

В 3,55 3,55 3,5 3,45 3,45-3,55 0,10 3,54 0,05

108, 108 108-116 8

111,5+4,0

ИМ1% 116 114

Та блица 5

Значение ИМ лейкоцитов периферической крови при использовании агаровых блоков с концентрацией сыворотки 0,8%

4 Интервал Разброс Среднее. значение

Вк 3,24 3,26 3,24 3,32 3 24-3 32 0,08 3,26510 04

120 106 106-120 14 112,37+7

04,% ill 65 112 р, 3,4 3,46 3,55 5,42 3 3-3,55 0,15 3,46i0,075

1076090

Т а б л и ц а 6

Значение ИМ лейкоцитов периферической крови при использовании агаровых блоков с концентрацией сыворотки 0,5%

Среднее значение

Разброс

Интервал

Ry 3t 0 Зк 15 3i 08 Зк 12 Зк0 3е 15 0 к 15 Зк087+Ор 075

R 3,25 3,45 3, 1 3,3 3,1-3,45 0,35 3,275+0,175

ИМ,Ъ 118 120 101,5 112 101,5-120 18,5 112,6у9,25

Таблиц а 7

Значения ИМ лейкоцитов периферической крови после окрашивания при использовании угаровых блоков а концентрацией сыворотки 1,5%

Интервал Разброс

1 2

Среднее значение

Вк 365 3,88 3,6 3,62 36-388

0,22 3,6910,11

Во .3,75 3,95 3,82 3,8

3,75-3,95 0,2 3,8310;1

ИМ,Ъ 106 303 112 110

10 3-112

107,75 4,5

Та блица 8

Значения ИМ лейкоцитов периферической крови после окрашивания зон миграции н при использовании агаровых блоков с концентрацией сыворотки 1 0%

4 Интервал. Раз брос

Среднее значение

R 3,37 3, 375 3, 38 3, 38 3, 37-3, 38 0,01 3, 376+0,005

Ro 3t42 3:46 3:48 3i48 3 42 3:48 Or06 Çф4610г03

2,5 105,1т1,25

ИМ,Ъ 103,5 105 106 106 103,5-106

Тираж 688 Подписйое

ВНИИПИ Заказ 574/5

Филиал ППП Патент", r. Ужгород, ул. Проектная,4