Способ криоконсервирования живых одноклеточных организмов

 

СПОСОБ КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЯ ЖИВЫХ ОДНОКЛЕТОЧНЫХ ОРГАНИЗМОВ, включающий извлечение консервируемых объектов из среды культивирования , предварительную инкубацию их при 2-3°С в течение 1,5-2 ч, замораживание с использованием жидкого азота, отличающийся тем, что, с целью повыщения жизнеспособности одноклеточных организмов , объекты, подлежащие консервированию , обезвоживают путем повышения концентрации хлористого натрия в среде культивирования до 1 -1,2% и инкубации в этой среде в течение 5-30 мин, а замораживание осуществляют в течение 0,1 - 0,2 с со скоростью

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК зов А 01 N 102

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ 1 .

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3444164/30-15 (22) 24.05.82 (46) 28.02.84; Бюл. № 8 (72). Н. А. Шубин и Л. В. Калинина (71) Институт цитологии АН СССР (53) 578.68 (088.8) (56) 1. Low Temperature Preservation in

Medicine and Biology. Ed. М. J. AshwoodSmith, J. Farrant, Kent, 1980, р. 4 — 25.

2. Лозина-Лозинский Л. К., Николаева Т. В. Устойчивость Агпоева proteus к замораживанию под защитой полиэтиленоксида-4000. — «Цитология», 1980, 22, II, с. 1357 — 1363 (прототип).

„„SU„„1076054 A (54) (57) СПОСОБ КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЯ ЖИВЫХ ОДНОКЛЕТОЧНЫХ

ОРГАНИЗМОВ, включающий извлечение консервируемых объектов из среды культивирования, предварительную инкубацию их при 2 — 3 С в течение 1,5 — 2 ч, замораживание с использованием жидкого азота, отличающийся тем, что, с целью повышения жизнеспособности одноклеточных организмов, объекты, подлежащие консервированию, обезвоживают путем повышения концентрации хлористого натрия в среде культивирования до 1 — 1,2% и инкубации в этой среде в течение 5 — 30 мин, а замораживание осуществляют в течение 0,1—

0,2 с со скоростью (3 — 10) 10 град/с в смеси жидкого и твердого азота.

1076054

Гибель консервируемых организмов при осуществлении известных способов вызвана повреждением их структуры в результате внутриклеточной кристаллизации воды, а также большой токсичностью криопротекторов. При этом сокращение продолжительности обработки объектов криопротектором (менее 0,5 ч) ускоряет кристаллообразование при замораживании.

Увеличение продолжительности обработки криопротектором свыше 1 ч, наоборот, усиливает токсическое действие последнего.

Цель изобретения — повышение жизнеспособности одноклеточных организмов.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу криоконсервирования живых одноклеточных организмов, включающему извлечение консервируемых объектов из среды культивирования, предваритель45

Изобретение относится к криобиологии и может быть использовано для криоконсервирования различных биологических объектов, в частности свободноживущих одноклеточных животных, при проведении научных исследований, а также в микробиологии и медицине.

Известен способ консервирования биологических объектов путем замораживания их в различных хладагентах. При этом объект предварительно обрабатывают крио- 10 протекторами, повышающими вязкость их цитоплазмы, а замораживание производят в хладагенте, например жидком азоте.

Замораживание чаще всего проводят путем ступенчатого охлаждения объектов с

15 широким .диапазоном градиента понижения температур от 0,2 град/мин до 1000 град/с (lj.

Этот способ позволяет криоконсервировать только клетки организмов либо низшие организмы, например, соматические клетки, спермии, цисты, бактерии, водо- 20 росли и паразитические простейшие.

Однако этот способ не пригоден для консервирования свободноживуших одноклеточных животных, например амеб и инфузорий, так как при его осуществлении животные погибают.

Наиболее близким к предлагаемому является способ криоконсервирования амеб, согласно которому живые одноклеточные организмы извлекают из среды культивирования и в течение 0,5-1 ч обрабатыЗ0 вают криопротектором. Затем объекты размещают на подложке, алюминиевой фольге, и подвергают медленному ступенчатому замораживанию в жидком азоте со средним градиентом 1 град/мин либо быстрому замораживанию с градиентом 500 град/ мин (2).

Однако после размораживания, т. е. извлечения из хладагента и помещения в среду культивирования при 20 С все амебы погибают в течение 10 — 20 мин. 40 ную инкубацию их при 2 — 3 С в течение

1,5 — 2 ч, замораживание с использованием жидкого азота, объекты, подлежащие консервированию- обезвоживают путем повышения концентрации хлористого натрия в среде культивирования до 1 — 1,2% и инкубируют в этой среде в течение 5 — 30 мин, а замораживание осуществляют в течение

0,1 — 0,2 с со скоростью (3 — 10) 10 град/с в смеси жидкого и твердого азота.

Пример 1. Предварительная инактивация объектов путем понижения температуры среды культивирования до 2 — 3 С и выдерживания их в этих условиях в течение 1,5—

2 ч является наиболее оптимальной для достижения максимальной выживаемости их, что установлено опытным путем.

Повышение концентрации NaC1 в среде культивирования и выдерживание в ней объектов необходимо для обезвоживания и повышения вязкости их цитоплазмы. Это принципиально сходно с действием криопротектора, но исключает побочный токсический эффект последнего. Режимы повышения концентрации NaC1 (1,0 — 1,2%) оптимальны. Такое воздействие в течение

5 — 30 мин, обеспечивает мягкое частичное обезвоживание объектов без гипертонических повреждений.

Последующее сверхбыстрое замораживание объектов осуществляют путем быстрого помещения их в шугообразный азот.

Установлено, что оптимальный эффект замораживания достигается при скорости помещения объектов в шугообразный азот в пределах О 1 — 0 2 с. При этом режиме помещения объектов градиент скорости замораживания составляет (3 — 10) 10 град/с. Такой сверхвысокий градиент замораживания обеспечивается низкой температурой шугообразного азота (смеси твердой и жидкой его фаз), равной — 215 С, которая значительно ниже температуры жидкого азота, равной — 196 С, а также консистенций шугообразного азота. Опытным путем установлено, что оптимальный эффект соохранения жизнеспособности объектов достигается только в химически чистом шугообразном азоте при оопределенной его плотности. Для достижения этого состояния шугообразного азота давление воздуха в сосуде с жидким азотом понижают до режимов разрежения 1,0 — 0,1 Па. Разрежение воздуха в сосуде ниже 1,0 Па приводит к затвердению смеси, а выше 0,1. Па к преобладанию в ней жидкого азота. Необходимая плотность шугообразного азота достигается при содержании в .смеси твердой фазы азота в пределах 55 — 60%. При разжижении смеси (менее 55% твердой фазы) происходит вскипание азота вокруг объекта, а при ее уплотнении (свыше 60%) возможны механические повреждения объектов.

1076054

После сверхбыстрого замораживания объектов консервирование их в течение необходимых сроков осуществляют как в шугообразном, так и в жидком азоте.. При хранении шугообразный азот переходит в жидкое состояние, при этом повышение температур криоконсервирования до †1 С не влияет на выживаемость объектов.

По истечении необходимых сроков консервирования объекты быстро переносят во влажную камеру. Скорость переноса для достижения требуемого градиента размораживания (3 — 10) .. 10 град/с сохраняется равной 0,1 — 0,2 с. Эти режимы переноса, такие же, как и при замораживании объектов, необходимы для преодоления процесса рекристаллизации внутриклеточной жидкости при ее переходе в жидкое состояние.

Опытным путем установлено, что наилучшая выживаемость объектов достигается при температуре воздуха в камере (25—

27 С), близкой к пределу температурного оптимума их содержания. При таком диапазоне температур и повышенной влажности воздуха в камере (близкой к 100О/o) скорость размораживания объектов и условия их перевода в активное состояние оптимальнуе, чем в обычных комнатных условиях при 18 — 20 С.

Окончательный перевод объектов в среду культивирования осуществляется в течение

5 — 10 с после размораживания. Режим перевода 5 — 10 с оптимален, так как выдерживание объектов в камере не менее 5 с необходимо для их температурной акклиматизации к условиям активной жизнедеятельности. Превышение этого срока более 10 с приводит к осушению объектов.

Наиболее удобно осуществлять перевод объектов в среду культивирования путем добавления последней в виде капли к объекту, что установлено опытным путем. При этом превышение объема среды культивирования в 2 — 3 раза по сравнению с объектом является оптимальным для взаимной стабилизации температур, а также для достижения минимально .необходимых условий активации объектов в этой среде.

Теоретической основой использования эффекта витрификации объектов при исполнении нового способа их сверхбыстрого замораживания является следующее.

При быстром погружении объекта в шугоообразный азот выделяемое им тепло расходуется в основном на плавление твердой фазы смеси. Жидкий азот, получаемый в результате такого расплавления, в свою очередь охлаждается окружающей его шугой. Поэтому он не успевает достичь точки кипения (†1 С) и, соответственно, не образует газового пузыря вокруг объекта.

При замораживании объекта в жидком

Пример 2. Способ криоконсервирования живых одноклеточных организмов испытывают на лабораторных одноклеточных животных — амебах (Amoeba Proteus) и двух

gp видах инфузорий (Tetrachymena u Bursaria). Массовая культура этих животных содержит несколько тысяч особей и находится в среде культивирования объемом 25 мл.

Часть особей (около 100 штук амеб, бурсарий либо несколько тысяч тетрахимен) вмес45 те со средой культивирования общим объемом 2 мл отделяют пипеткой Пастера от массовой культуры и помещают в отдельную емкость, например, бюкс, который помешают в холодильник с температурой 2—

3 С на 1,5 — 2 ч. В" пределах указанных сроков к среде культивирования с объ50 ектами добавляют охлажденный до -этой же температуры раствор поваренной соли исходной концентрации 2,2 — 2,5О/o и объемом 2 мл. Концентрацию поваренной соли в среде культивирования устанавливают в пределах 1,0 — 1,2О/р. В этих условиях объекты выдерживают в течение 5 — 30 мин в разных сериях опытов. После этого объ5

35 азоте газовый пузырь, препятствуя теплоотдаче, снижает скорость охлаждения объекта по меньшей мере до 1000—

1500 град/с. При погружении объекта в шугообразный азот скорость его охлаждения максимальна и более постоянна по сравнению с ранее достигнутой. Скорость охлаждения зависит только от величины объекта, находясь в обратной пропорции от нее. Поэтому градиент замораживания (и размораживания) объекта в шугообразном азоте находится в пределах (3 — 10) Х

X 10 град/с. Этот градиент установлен с помощью установки — комплекса микротермопары, подключенной к осциллографу с фотоприставкой. Сходную величину градиента, близкую к 6 10 град/с, удалось получить и теплофизичес/ ими проверочными расчетами. Такие сверхвысокие скорости изменения температуры объекта превышают верхние пределы скорости кристаллообразования внутриклеточной воды при прохождении его порога кристаллообразования, равного — (50 — 70) С. Поэтому кристаллообразования не происходит и вся внутриклеточная жидкость объекта переходит в гелевое состояние, т. е. происходит, витрификация объекта (переход в стекловидное тело). Сходный механизм сверхбыстрого перехода внутриклеточной жидкости из гелевого состояния в жидкое имеет место и при размораживании объекта. Обычного в таких условиях процесса рекристаллизации воды при — (50 — 70) С не происходит. Указанные сверхвысокие скорости криоконсервирования могут быть обеспечены только совокупностью перечисЛенных операций, производимых в указанной последовательности.

1076054

35 азоте объекты содержат в течение необхо- 40 димых сроков криоконсервирования, при этом постоянно поддерживают уровень заполнения азота в рабочем сосуде. Для размораживания объектов металлическую подложку вместе с ними в течение 0,1 — 0,2 с извлекают из рабочего сосуда с жидким 45 азотом и переносят на предметное стекло, помещенное во влажной камере при 25—

27 С. В качестве камеры используют помешенную в термастат при 25 — 27 С закрытую крышкой чашку Петри с вложенными в нее влажным фильтром и предметным стек- 0 лом для размещения на нем объектов. Чашку Петри предварительно содержат в течение 1 ч в термостате при этой температуре. В течение 5 — 10 с после помещения объектов на предметное стекло во влажной камере к объектам добавляют среду культивирования обычного состава (раствор Прескотта), нагретую до той же темпеекты извлекают из среды культивирования и при той же температуре помещают на пластинку-подложку из алюминиевой фольги. Объекты при этом располагают на подложке в отдельных микрокаплях, в каждой

2 — 50 амеб или бурсарий либо до нескольких сот тетрахимен. Диаметр капли суспензии в пределах (2 — 5) . 10 нм. После этого подложку с находящейся на ней каплей с объектами вручную быстро, в течение

0,1 — 0,2 с погружают в шугообразный азот, который предварительно готовят следуюшим образом.

Стеклянный узкогорлый сосуд Дьюара (рабочий) заполняют жидким азотом до половины объема. Помещают в другой сосуд Дьюара (больший по объему) а пространство между ними заполняют жидким азотом или твердой углекислотой для дополнительной теплоизоляции рабочего сосуда. Последний соединяют с вакуумным насосом, с помошью которого понижают давление до 1,0 — 0,1 Па, При таком разрежении воздуха в рабочем сосуде,жидкий азот переходит в шугообразное состояние. Затем давление воздуха в рабочем сосуде повышают до атмосферного в течение 1,0 — 1,5 мин и металлическую фольгу с нанесенным ранее животными вручную

1 в течение 0,1 — 0,2 с погружают в шугообр азн ый азот.

Измерение скоростей охлаждения в каплях клеточной суспензии проводят с помощью комплекса микротермопары, подключенной к осциллографу с фотоприставкой.

Скорость замораживания объектов находится в пределах (3 — 10) . 10 С/с. После этого рабочий сосуд Дьюара с замороженными в нем объектами извлекают из большего наружного сосуда Дьюара и помешают в обычные комнатные условия.

Шугообразный азот переходит в жидкое состояние в течение 15 — 20 мин. В жидком

25 ратуры и в объеме одной микрокапли

0,01 мл. После этого влажную камеру с объектами извлекают из термостата и помешают в комнатные условия при 18 — 21 С.

По истечении 20 мин после разморажи.вания к объектам добавляют 1 — 2 капли среды культивирования и производят оценку степени выживаемости и физиологического состояния объектов.

Оценку этих показателей проводят с помощью визуального наблюдения животных под бинокуляром марки МБС-1 при увеличении в 20 раз. Выживаемость животных определяют по наличию внутриклеточных токов цитоплазмы, способности прикрепляться к субстрату и двигательной активности в поисках пищи. Физиологическое состояние амеб оценивают по их способности к делению, бурсарий и тетрахимен — по их подвижности. Наблюдения в течение 2 — 3 недель после размораживания показывали, что у амеб темпы клеточного деления, морфологические показатели такие же, как у контрольных животных; 100О/ц выживших после криоконсервирования животных дали постоянные клоны.

При этом длительность пребывания животных в шугообразном азоте не влияет на выживаемость животных после криоконсервирования. Для сравнения результатов одновременно проводят опыт по криоконсервированию животных по способу-прототипу с использованием жидкого азота. Каждый опыт воспроизводят в 10 — 12 раз. В результате из 85 тыс. живых одноклеточных организмов указанных видов сохраняют жизнеспособность после криконсервирования 14860 особей, из которых 8069 способно к репродукции.

Положительный эффект, достигаемый при осуществлении способа, заключается в сохранении жизнеспособности живых одноклеточных организмов, что не удавалось достичь известными способами. Предлагаемый способ является более простым и оперативным по сравнению с прототипом, поскольку продолжительность всех операций замораживания и размораживания объектов сокращается в несколько раз.

Основной технико-экономический эффект от использования изобретения состоит в расширении возможностей проведения научных исследований на одноклеточных организмах в различных областях биологии и медицины.

Помимо прямого назначения — сохранения жизнеспособности свободноживущих целостных одноклеточных организмов способ может быть также использован для криоконсервирования клеточных культур с целью сохранения исходных чистых клеточных линий. Эта, в свою очередь, дает возможность создавать коллекции криоконсервированных клеточных культур.