Штамм @ @ вкм в-1454 д-продуцент литического фермента

 

ШТАММ PSEUDOMONAS LYTICA. ВКМ В-1454 Д (Всесоюзная коллекция культур микроорганизмов при Институте .биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР, коллекционный номер ВКМ В-1454Д) -продуцент литического фермента. (Л с:

l l9) О! )

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ .РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPCKOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И OTHPblTHA (21) 3425910/28-13 (22) 10.02.82 (46) 30.06.85. Бюл. Ф 24 (72) М.А. Бобык, И.С. Кулаев, В.А. Ламбина, З.С. Плотникова, А.И. Северин, Е.Л. Таусон и Л.Г, Чуркина (71) Институт биохимии и физиологии микроорганизмов AH СССР (53) 577. 15(088.8) (56) 1. Патент Англии У 1353877, кл. С 12 D 13/10, опублик. 1974.

Патент Англии У 1132678, кл. С 12 d 11/00, опублик. 1968.

3. Патент США М- 3124517, кл. 195-66, опублик. 1964.

4. Патент Англии ll 1379176, кл. С 12 D 13/10, опублик. 1975 (прототип).

4(з1) С 12 К 15/00; С 12 N 9/24 (54) ЫГАММ PSEUDOMONAS LYTICA ВКМ

В-1454 Д-ПРОДУЦЕНТ ЛИТИЧЕСКОГО ФЕР-.

МЕНТА, (57) ШТАММ PSEUDOMONAS LYTICA. ВКМ

В-1454 Д (Всесоюзная коллекция культур микроорганизмов при Институте ,биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР, коллекционный номер

ВКМ В-1454Д) — продуцент литического фермента.

1075740

Изобретение относится к микробиологической промышленности, производящей ферментные препараты, и может быть использовано в фармацевтической и медицинской промьппленактивность.

Кроме того, велико время культивирования штаммов продуцентов, а получаемый препарат не лизирует штаммы следующих родов микроорганизмов:

StrePtococcus, Chromobacterium, Flavobac ter ium, Kur th ха, Sarc ina, Neisseria.

Целью изобретения является штамм

Pseudomonas lytica BKM В-1454Д, обладающий высокой литической активностью.

Поставленная цель достигается использованием в качестве продуцента литического препарата неописан- 55 ного ранее штамма Pseudomonas lytica

BKN В-1454 Д, выделенного из воды реки Оки в ареале максиального ности.

Фермент может найти широкое применение при борьбе с инфекционными заболеваниями, вызванными граммположительной микрофлорой. l0

Наиболее распространенными продуцентами фермента литического действия являются различные виды бактерий, например, Achromobacter

lunatur 11), Flavobacterium j2), 15

Bacillus cereus P3j и др.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту из известных штаммов является

Pseudomonas aeruginosa (4), процесс щ культивирования которого ведут в течении 72 ч при 30ОС, pH 7,4 в среде, содержащей 2-57 нормальных парафинов (С << вЂ С ), 0,67 мочевины, 0,057. КН РО, 0,05Х ИаН РО+, 25

0,05 NgSO, 0,1X дрожжевого экстракта, 10 мкг/мл FeSO<, 10 мкг/мл СаС1 .

Для ocaждения литического фер— мента используют сугьфат аммония (ЯОЕ насыщения) или этанол в соотношении 3: 1 . Полученный таким обра— зом литический препарат лизирует следующие .. икроорганиэмы: пс евдомонады, микрококки. стафилококки, бациллы. Бак гериолитическая актив3 ность фермента составгяет ?Π†8 лизиса тест -культура в 1 ч.

Основным обшим недостатком известных штаммов является их низкая распространения микроорганизмов, лизирующих стафилококки .

Штамм Pseudomonas lytica ВКМ

В-1454 Д характеризуется следующими свойствами:

Морфологические и культуральные признаки:

Грамотрицательные палочки, не образующие спор, 0,5-0,8 3-5 мкм, слегка искривленные монотрихи, клетки подвижные.

Колонии на МПА бесцветные, с ровным краем, при старении слегка мор— щинистые в центре. При росте в

МПБ образуют осадок, муть, пленку.

Флуоресцирующий пигмент не продуцирует.

Физиолого-биохимические свойства.

Строгий аэроб, растет при температуре от 4 до 37 С, не растет при 41 С, оптимальная темпера. гура

28 С.

Метаболизм глюкозы дыхательный.

В качестве источника углерода использует арабинозу, глюкозу, галактозу, сахароэу, мальтоэу и ацетат натрия. Не использует ксилозу, фруктозу, рамнозу, лактозу, рафинозу, соли щавелевой, молочной, яблочной, лимонной и глутаминовой кислот, глицерин, дульцит, маннит, сорбит, инозит, инулин.

Не нуждается в факторах роста.

Способна расти на минеральной среде без факторов роста.

Оксидазная и каталазная активности — положительные.

Не образует хитинаэу, целлюлазу, уреазу, сероводород, индол. .Гидролизует крахмал.

Не разжижает желатину.

Пептонизирует молоко.

Редуцирует нитраты.

Не обладае" липолитической активностью (40, 60, 80 — твины).

Аргининдигидродаза отсутствует.

Процентное содержание Г+Ц 59,5Х.

Хранится на MTIA, иэ-за энергичного автолиза требует пересевов через

7-10 суток. Штамм Pseudomonas lytica хранится, не теряя жизнеспособности и активности, под слоем вазелиноього масла или в лиофильно сухом состо- . янии.

При росте на твердой среде, содержащей стафилококк, образует крупные зоны ливиса вокруг своих колоний. патогенных микроорганизмов из коллекции Государственного, научноисследовательского института стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов МЗ СССР им. Л.А. Тарасевича.

Результаты проведенных исследований представлены в табл. 1 и 2.

Из таблицы видно, что литический

10 препарат из культуральной жидкости нового штамма Pseudomonas lytica активен в отношении клеток грамположительных микроорганизмов:

Arthrobacter

globiformis ИБФМ В-126

А. citreus

А. cristal20 lopoietes

В-151

В-52

В-59

А. tumescens

Muc roc occu s

luteus

Sarc ina

aurantiaca

В-531

D-80

В-82

Staphylococcu s

aureus В-83

Менее интенсивный лизис наблюдался под действием фермента на некоторые виды флавобактерий, а также на Kurthia zophfii В-183 и на хромобактерии. С высокой скоростью

40 препарат лизировал прогретые клетки ках многих грамположительных, так и многих грамотрицательных организмов.

Препарат показал высокую актив4> ность в отношении всех опробованных штаммов стафилохокков и микрококков, выделенных от больных. Менее эффективно препарат действовал на стрептококки групп В и Д, а также на некоторые стрептококки группы А.

Грамотрицательные патогенные микроорганизмы, за исключением Neisseria, оказались устойчивыми к действию фермента.

Пример. Штамм Pseudomonas

lytica В-1454 Д выращивают в жидкой среде, содержащей 0,01Х дрожжевого экстракта (Difco), 0,063 казаминовых з 1075740

НОвый штамм вьщелен иэ воды реки

Оки в ареале максимального распространения микроорганизмов, лизирующих стафилококки.

На основе морфологических, культуральных и физиолого-биохимических свойств новый штамм согласно опреде1 лителю Берги 8-ro издания, относится к роду Pseudomonas.

Излучение свойств нового штамма не позволяет отнести его ни к одному из 26 видов рода Pseudomonas, представленных в определителе. По ряду свойств: способности расти на минеральной среде без факторов роста, составу Г+Ц, способности к денитрификации и росту при 4 1 С, наиболее близок к виду Pseudomonas cichorii.

Однако от этого вида ее отличает способность гидролизовать крахмал и неспособность образовывать флуорес-: цирующий пигмент.

На основании этого культуре дано видовое название Pseudomonas lytica.

Продуцент литического препарата

Pseudomonas lytica .ВМК В-1454Д выращивают в среде, содержащей 0,0080,0127 дрожжевого экстракта, 0,060,083 казаминовых кислот, 0,51,5 мг/мл автоклавированных, лиофильно высушенных клеток стафилококка при рН среды 8,0-8,3, культивирование проводят в течение 18-20 ч при 22-25 С. Вьщеляют целевой продукт после отделения клеток от культуральной жидкости известными методами.

За единицу литической активности (Е/мл) принято такое количество фермента, которое вызывает падение оптической плотности суспензии живых или автоклавированных клеток тест — организма (Staphylococcus

aureus) в 0,01 M фосфатном буфере, рН 8,5, на 0,01 оптическую единицу в 1 мин. Удельную литическую активность (Е/мг) рассчитывают как отношение активности фермента к количеству белка в том же объеме. .1

Литическое действие препарата проверяли на живых и прогретых (80 С в течение 20 мин) клетках 38 видов грамположительных бактерий, 3 видов нокардий, 4 видов микробактерий, 27 видов грамотрицательных микроорганизмов и 19 видов дрожжей из коллекции культур ИБФМ АН СССР, а также на клетках 133-х штаммов

1075740

Таблица 1

Действие литического препарата из культуральной жидкости

Pseudomonas lytica на различные микроорганизмы (коллекция культур ИБФМ АН CCCP) Время действия препарата, мин

Тес т- культура

Процент лизировавших клеток

-г интактных прогретых Arthrobacter

globiformis

90 92

88 94

ИБФМ В-126 90 — В-151 89

97

А. сitreus

А. cristallopoietes

94 97 100

В-52

95 кислот (Difco), 1 „0 мгlмл автоклавированных лиофильно высушенных клеток Staphylococcus aureus npu рН 8,3 20-24 ч при 24 С на качалке в 100 мл среды в медицинских колбах объемом 750 мл . Клетки отделяют центрифугированием на холоду при

6200 g в течение 40 мин.

К полученному прозрачному супернатанту добавляют разбавленную уксусную кислоту до установления рН 6,7 H pac sop MgC1> до конечной концентрации 10 М.

Обработанный вышеописанным способом супернатант наносят на колонку 2,5 >25 см с гидроксилаппатитом (Мазин А.Л., Сулимова Г.Е,, Биохимия, 1975, т. 40, вып. 1). После нанесения колонку промывают 0,01 М натрий-фосфатным буфером рН 6,8, содержащим 10 MgC1> . Десорбцию ве— дут натрий-фосфатным буфером рН 6,8, образующим градиент моляр-, ности от 0,01 до 0,15 M Максимальная литическая активность элюируется при концентрации буфера 0,08-0,1 M.

Полученный таким образом препарат имеет удельную активность 10001500 Е/мг.

Физико-химические характеристики литического препарата.

Температурный оптимум препарата

45-50 С .

Оптимум pH — 8,5.

Оптимум молярности фосфатного буфера 0,01 М.

Препарат стабилен при температуре ниже 40 С и инактивируется при

15-минутном прогреве при 60 С.

5 Таким образом, преимущество предлагаемого штамма по сравнению с известным заключается в том, что активность получаемого препарата значительно выше, чем известного.

Так, например, лизис тест-культуры

Staphylococcus aureus получаемым препаратом из Pseudomonas lytica протекает на 100Х в течение 5 мин, в то время как из Pseudomonas aeruginosa лизис Staphylococcus aureus протекает на 86,4Z за 1 или 4 часа.

Фермент обладает иным спектром литического действия. В известном

20 техническом решении препарат лизирует представителей родов Staphylococcus, Micrococcus, Bacillus, Corynebac ter ium, Lac tobac il lu s, Pseudomonas Proteus Ervinia

У 9

Azthrobac ter, Achromobac ter, Легошопа s, Кап thomona s .

Получаемый препарат лизирует интактные клетки представителей

30 родов Staphylococcus, Micrococcus, Arthobacter, Chromobacterium, Bacil—

1us, Strep toe occu s, Fl avobac ter ium, Kurthia, Sarcina, Neisserid.

Кроме того, почти все исследован—

- 5 ные тест-организмы лизируются препаратом после их прогревания при

80 С (см. табл. 1) .

1075740

Тест культура арогретвас интактнык

ИВФМ В-59

96

А. tumescens

А. simplех

93 95 100

34 45 56

В-58

Bac.illus

badius

В-507 0

В-523 0

В. сoagulans

В. f irmus

В-531

В-585

В. sub til is

Cellulomonas

flavigena

В-136 0

32 40

Corynebacteгмбх insi-.

diosum

В-137 0

57 . 67

С.с. michiganense

20 29

В-71

F 1avobac ter ium devoВ-140

В-180

66 80 87

77 81

rans

37

В-129

41

56 66

67 78 100

В-127

F. proteus

34

Kur th ia

zophf ii

В-183

62 7$

Micrococcus

luteus

В-80

N. radiodurans

94 96 100

ИБФ 1700

Ped ioc occu s

cerevisiae

19 24

71 79 100

ИБФМ В-1 73

В-190 0

P. halophilus

F. aquatile

t.

F. arborescens Продолжение табл . 1

Время действия преаарата, мин

5 10 20 5 10 20

Процент лизировавиих клеток

68 79

77 85

33 45 49

5.1 60

100 71 80 87

1075740

Тест- культура интактных

Sarcina

aurantiaca

ИБФМ (В-82

53 70

42

Sporosarcina

ureal

53 66 76

В-99

Staphylococcus

aureus

100

В-83

Streptococcus

faecalis

15 20

В-106 0

Agrobac ter ium

tumefaciens

В-48

В-152

А. radiobac ter

Aегоmonas

1iguåfàñiens

74 82

В-47

Alcaligenes

faccalis

А. paradoxu s

Caulobacter

bactегоides

ВС-4

ВС-44

rutilus

С. variabilis

ВС-5

Chromobacterium

1ividum

23

17

С. violaceum

Entегоbacter

cloacca

69 75

В-69

0.Ervinia

herb irola

78 82

86 89

В-32

В-72

Е. caratovora

Escher ich ia

coli К"12

78 83

В-78

S, epidermidis -"- В-118 0

В-166

В-154

В-123

В-171

Продолжение табл. 1

Время действия препарата, мин

5 JO 20 5 10 20

Процент лидировавших клеток прогретых

88 98 100

88 100

31 39

55 68

62 76 100

60 71 100

67 75

44 48

73 84

81 100

66 78 100

1075740

»»»» »»»» % В» В »

Време действие apenapara, кйн

Тест -«улвтура

10 20 5 1Ь 20

Процеят лмзировавюкх клеток нктактвмх лрогретых

Proteus

vulgaris

Pseudomonas

aeruginosa

80 83

ИБФМ В-1

О

В-14

P. aurantiaca

Р, сЫогогарЬ|в

О

В-121 О

P. fluorescens

О

В-15 О

В-20 О

В-148 О

P. putida

P. stutzeri

О

Serratia

marcescens

В-63

51 62 71

О

Vibrio

costicola

59 59

55 60

В-! 81 О

В-174 О

У. adaptatus

Kan thomona s

malvacearum

60 ?1 100

55 69 69

О В-89

О

К. campestris

В-86

О

14 22

Y-50

Y-59

О

С. lipolytica

43 100

О

Hancenula

anomala

7-268 О

32 39

15 . 19

Н. saturnus

Y-284 О

Torulopsis

sphaerica

7-465 О

34 40

О

Kloechera

brevis

Y-275 О

48 53

РЬайй iarhodozyma

Y-745 О

24 24

Candida guilliermondii var

mambranaefa. ciens

ИБФИ В-81 О О О

gpopoäæåíèå табл. !

50 55 100

7t 83

48 53

58 72 76

74 82

70 70!

I4!

075740

Продолжение табл. 1

Тест культура

Процент лиэировавших клеток

1 инт акт йых прогретых

Rhodotorula

aurantiaca

ИБФИ Y-295 25 30

R ° glutinus.

Y-319

22 25

Y-511

21 26

Candida

util is

Y-105

0 0 0

1803

0 0 0

0 0 0

BKM 1 540

Torulopsis

magno1 iae — 7,0 8,0

Y-429 0

Nadson ia.

Еи1vesc еп в

0 0 0

Y-289 0

Y-292 0

Y-319 0

Saccharomyces

cerevisiae

Y-357 0

12,5 17,8

Saccharomyces

carl sbergensis

Y-335 0

7-393 0

0 0 0

Zygosaccharoтпусes thermotolerans

Cryptococcuslavrentia

Cryptococcus

albus var

terreus

Pichia

membranae faciens

Rhodotorula

glutinus

Shizosaccharomyces pombe

Время действия препарата, мин

12,2 16,5

22 25

1075740

15

90,6

74

91,7

209 Р

94,1

77 96,7

"Виотко"

97,2

"Жаев"

95,4

"Лепин"

95 0

0-15

906

94,7

800

94,7

94,1

СВ

100

100

600

100

100

100

100

100

"Иванов"

100

"Беляев"

100

100

100

100

93,8

629

Тест-культура

Staphylococcus

aureus

Staphylococcus

aureus

"Антонов"

"Макаров"

"Смирнов"

"Орехов"

"Лоссманов"

Т-10

Б-243

"Королев"

Время действия препарата, мин

Таблица 2

Процент лизированных клеток

17

1075740

Г !

96,9

94,1 Терехов

93,3

1403

94,1

"Байков"

100.10

"Громов"

100

100

"Дубин"

100

"Кичеев"

100

100

Кузнецов"

100 Курдюмов

100 Мушкин"

93,8

100

"Нураев". 5

100 Обломов"

1 Панюков

100

"Сыревич"

100

100

100

"Фили!!лов"

100

"Фролов"

100

100

"Wood-46"

100

V-8

100

F-49

10 мин

100

474

5 мин

97,5

8056

100

977

100

Staphylococcus

aureus

Staphylococcus

aureu s

"Никифоров"

"Урусов"

"Фатаев"

"Цветкова".

Продолжение табл . 2

1075740

100

10 мин

6.80

100

1О

2586

10 ч-7

52260

52186

100

100

107

2626

100

120

66,7

"Якунин"

2124

100

10!

100 ч-1

883

100

i0/60

88,2

71,4

2665

97,2

100

5385

45,5

240

1512

240

31,25

284

240

73,3

38,5

240

291

240

73,9

654

Dick 11

90,0

Staphylococcus

aureus

Staphylococcus

epidermidis

Staphylococcus

saprophyticus

Nicrococcu s

luteus (Йlavus) М. varians (Sarsinalu tea) 9341

М. luteus

М. varians

Streptococcus

viridans стрептококки группы А:

Streptococcus

pyogenes

Продолжение табл, 2

100 ф

100

1075740

57,9

"Маятников"

240

"Мухранов"

240

91,7

Ч-9

91,2

1347

56,25

365

87,5

75,0

Д-Прага

1478

72,2

Dipl oc occu s

pneumonia e

240

1752

240

28,6

240

1018

9,1

1911

240

13,0

1914

240

240

1920

19,2

240

1922

29,4

240

231

1926

240

5,3

270

47,4

270

57,1

270

62,5

270

40,0

Streptococcus

pyogenes стрептококки группы В:

Streptococcus

agalacti. стрептококки группы Д:

Streptococcus

faecalis

var ° 1iguefaс iens

S. faccalis.

var. zymogenes

Corynebacterшт

kегоsis

Corynebacterium

diphthегоides

С. pseudodiph ther i t icum

С. diphthегоides

Neisseria

meningitidis

0638грС

135 Wrp. 135W 208гр .A

291rp. Z

Продолжение табл. 2

) 075740

1642гр.В

59„1

270

47,1

240

29 Е

26,3

293

240

240

37,5

674

50,0

240

13090гр. В

43,3

240

0196

150

50 0

"Бадашова"

° "Чилищев"

66,7

1.50

64,3

150

"Зинченко"

"Демидов"

° 45, 5.

57, 15

"Русско"

150

150

"Васин" 50,0

120

1,20

13314

0120

S. moscov

120

120

120

S. itutaba

120

120

120

Shigel1à

flexneri

120

120

S. booydii

120

120

120

Neisseria

menihpitidis

Neisseria

gonorrhoeae

Salmonella makoma

S. california

S. arizonae

S. montaevidaco

S. infantis

S ° atlanta

S. brundenburg

S. sonnei S Klebsiella

ozaenae

1а 5236

ЭВ1 791

4с5224. тип 13 4311

5051

24

Продолкение табл. 225

1075740

Продолжение табл. 2

-1—

К. pneumon iae

444

120

8172

К, aегоgenes

120

К. rhinoselегоmatis

S 546

120

Proteus

rettgeri

979

120

Pseudomonas

aeruginosa

120

120

120

120

5/Перкидзе

120

Serratiamarcescens .

120

Составитель Фалунина

Редактор С.Титова Техред М.Надь Корректор Г.Решетннк

Заказ 4500/3

Тираж 525 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Некоторые штаммы обозначаются фамилией больного, от которого они были выдел е ны.