Кюветное отделение для биохемилюминометра
Полезная модель относится к устройствам для количественного измерения интенсивности свечения, возникающего в ходе протекания химических реакций (хемилюминесценции) и генерируемого биологическими объектами в процессе их жизнедеятельности (биолюминесценции). В частности, полезная модель предназначена для измерения слабых свечений жидких сред, содержащих компоненты ферментных систем, тканевые гомогенаты и клеточные суспензии и может быть использована в лабораториях биологического, медицинского и санитарно-гигиенического профиля. Сущностью полезной модели является одновременная оценка интенсивности свечения в одной пробе в двух различных диапазонах спектра, соответствующих максимумам световой эмиссии при хемилюминесценции и биолюминесценции. Предлагаемая для этого конструкция кюветного отделения, представляет собой цельнометаллический корпус (1) с центрально расположенной темновой камерой для размещения анализируемой пробы (2), имеющей два боковых окна (3) с соосными им цилиндрическими выточками для крепления двух независимых фотоприемников - фотоэлектронных умножителей (4). На оптическом пути от анализируемой пробы к каждому из ФЭУ в структурной связи с боковыми окнами кюветного отделения находятся перпендикулярно расположенные по отношению к ним щели (5), позволяющие размещать в них светофильтры (6), вычленяющие из световых потоков отдельные части спектра, соответствующие максимумам световой эмиссии для каждой из регистрируемых реакций генерации свечения: хемилюминесценции или биолюминесценции. Достигаемый технический результат заключается в создании возможности для одновременного, в том числе кинетического анализа хемилюминесценции и биолюминесценции в одной анализируемой пробе. В частности, данное техническое решение позволяет проводить биохемилюминесцентную оценку смесей «фагоциты: бактерии» с раздельной оценкой люминолзависимой хемилюминесценции фагоцитов (при 425±5 нм) и биолюминесценции бактериальных клеток-мишеней (при 495±5 нм). (Фиг.1)
Область техники, к которой относится полезная модель.
Полезная модель относится к области измерительных устройств, а именно к устройствам для количественного измерения интенсивности свечения, возникающего в ходе протекания химических реакций (хемилюминесценции) или генерируемого биологическими объектами в процессе их жизнедеятельности (биолюминесценции). В частности, полезная модель предназначена для измерения слабых свечений жидких сред, содержащих компоненты ферментных систем, тканевых гомогенатов или клеточных суспензий.
Задача определения интенсивности хемилюминесценции возникает при осуществлении исследований, ставящих своей целью количественную характеристику процессов образования активных форм кислорода при фагоцитозе, перекисном окислении липидов в сыворотке крови и др. Отдельное направление подобных исследований составляет так называемая «активированная хемилюминесценция», предусматривающая добавление к реакционным смесям особых веществ (например - люминола), способных при взаимодействии с продуктами химических реакций усиливать интенсивность свечения в сотни и тысячи раз.
Задача определения биолюминесценции возникает при проведении исследований различных биологических жидкостей и клеточных суспензий, основанной на измерении тушения спонтанного свечения природных или рекомбинантных люминесцирующих бактерий как результата взаимодействия с гуморальными или клеточными бактерицидными системами.
Таким образом, предлагаемая полезная модель предназначена для использования в лабораториях медико-биологического профиля, использующих в своей работе аналитические технологии, основанные на явлениях хемилюминесценции и биолюминесценции.
Уровень техники.
Типичный биохемилюминометр включает кюветное отделение с темновой камерой для размещения исследуемой пробы, сопряженный с ним фотоприемник (обычно высокочувствительный фотоэлектронный умножитель - ФЭУ), а также подключенную к
нему систему регистрации импульсов, последняя из которых позволяет количественно выразить интенсивность свечения (SU 1343249, опубл. 07.10.1987).
Среди технических решений, имеющих своей целью совершенствование и расширение возможностей биохемилюминометров, значительная доля принадлежит изобретениям, направленным на усовершенствование их кюветных отделений.
В частности, известно устройство для измерения хемилюминесценции и биолюминесценции жидкости, в котором с целью повышения эффективности регистрации предусмотрено термостатирование кюветы с анализируемым образцом, а сама кювета снабжена приводом для обеспечения ее вращения вокруг оси во время измерения (SU 1400258, опубл. 10.01.2000). При этом положительный результат от использования изобретения достигается за счет проведения реакций хеми- или биолюминесценции при определенной (стандартной) температуре, а также за счет постоянного перемешивания компонентов пробы, что исключает возможность их осаждения под действием силы тяжести.
Другое техническое решение (RU 2159422, опубл. 11.02.2000) предусматривает создание ведущего в темновую камеру отделение сквозного отверстия, закрытого светонепроницаемой шторкой, позволяющего вносить в исследуемую пробу различные компоненты и за счет этого получать начальную информацию о мгновенно начинающихся реакциях.
Более сложное исполнение кюветного отделения предназначено для оценки интенсивности свечения на поверхности хроматографических или иных пластин, на которых предварительно проведено разделение компонентов анализируемой пробы (RU 2234534, опубл. 20.08.2004). При этом дополнительным компонентом кюветного отделения является средство для нанесения светящихся клеточных структур на поверхность анализируемой пластины.
Описанные выше технические решения в каждый конкретный момент обеспечивают регистрацию только одного вида свечения. В то же время потребности аналитической химии и биологии часто связаны с задачей определения в одном анализируемом образце нескольких показателей, каждый из которых проявляется через генерацию светового импульса. Соответственно, основной причиной, препятствующей получению технического результата, который обеспечивается заявляемой полезной моделью, является отсутствие возможности одновременной регистрации интенсивности двух видов свечения: биолюминесценции и хемилюминесценции в одной и той же анализируемой пробе (в том числе кинетических измерений в режиме реального времени).
Из уровня техники известно «Устройство для регистрации при комнатной температуре люминесценции биологических мембран» (RU 2031400, опубл. 20.03.1995), предусматривающее возможность регистрации хемилюминесценции, фосфоресценции и флуоресценции одного и того же образца. При этом особенностью кюветного отделения данного устройства является наличие четырех вращающихся дисков, объединенных в две пары и неподвижной пластины между дисками каждой пары, что обеспечивает абсолютную защиту ФЭУ от внешнего света и, тем самым, регистрацию фосфоресценции и хемилюминесценции в режиме счета фотонов. Однако, подобное устройство предусматривает не одновременную, а поочередную регистрацию хемилюминесценции, фосфоресценции и флуоресценции, что к тому же требует использования дополнительного программного блока.
Альтернативные подходы, ведущие к устранению данных недостатков, в доступной нам литературе не описаны. Таким образом, в уровне техники не известно средство того же назначения, что и полезная модель, которому присущи все приведенные в независимом пункте формулы полезной модели существенные признаки.
Раскрытие полезной модели.
Основной задачей, на решение которой направлена заявляемая полезная модель, является создание технических возможностей для раздельного определения интенсивности хемилюминесценции и биолюминесценции одновременно в одной и той же пробе, что позволяет получить уникальную информацию о соотношениях между лежащими в их основе процессами, а также существенно сократить время проведения анализа.
Дополнительной задачей, решаемой при использовании предлагаемой полезной модели, является возможность растянутого во времени (кинетического) анализа процессов хемилюминесценции и биохемилюминесценции, позволяющего оценивать не только конечный результат реакции по некоим «конечным точкам», удаленным по времени от начала реакции, но и отслеживать ход самих этих реакций в режиме реального времени.
Таким образом, обеспечиваемый заявляемой полезной моделью технический результат заключается в создании новых возможностей для проведения исследования, сокращении времени его проведения, а также возможности сравнительного кинетического анализа хода ферментативных и биологических реакций, сопровождающихся генерацией свечения.
Сущностью заявляемой полезной модели как технического решения, выражающегося в совокупности существенных признаков, достаточных для достижения обеспечиваемого полезной моделью технического результата, является следующее:
- для одновременной раздельной оценки интенсивности хемилюминесценции и биолюминесценции в одной пробе, содержащих компоненты для названных реакций генерации свечения, предлагается ее помещение в темновую камеру, имеющую два независимых выхода для сопряжения с двумя отдельными регистраторами слабых свечений на основе ФЭУ, перед каждым из которых расположены щели для светофильтров с неидентичными (непрекрывающимися) полосами пропускания, соответствующим максимумам световой эмиссии реакций хемилюминесценции и биолюминесценции.
Среди перечисленных выше признаков наиболее существенным (влияющим на возможность получения технического результата и находящимся с ним в причинно-следственной связи) и отличительными от наиболее близких аналогов является обеспечение возможности регистрации свечения в двух различных частях спектра, что определяется различиями в максимумах световой эмиссии реакций хемилюминесценции и биолюминесценции. В частности, для регистрации активированной хемилюминесценции с использованием люминола, характеризующейся максимумом световой эмиссии при 425 нм, предлагается регистрация свечения на один из независимых фотоэлектронных умножителей с установленным между ним и анализируемой пробой светофильтром с полосой пропускания 425±5 нм. В свою очередь для регистрации в той же пробе биолюминесценции, характеризующейся максимумом световой эмиссии при 495 нм, предлагается регистрация свечения на другой независимый фотоэлектронный умножитель с установленным между ним и анализируемой пробой светофильтром с полосой пропускания 495±5 нм.
Краткое описание чертежей.
На фиг.1 (вид сверху) и фиг.2 (вид сбоку в сечении А-А) изображена конструкция кюветного отделения, являющегося основным структурным элементом заявляемой полезной модели в определении взаимоположения ее прочих элементов и определенным образом ориентирующим вокруг себя регистрирующие устройства биохемилюминометра.
Конструкция кюветного отделения, представляет собой цельнометаллический корпус (1) с центрально расположенной темновой камерой для размещения анализируемой пробы (2), имеющей два боковых окна (3) с соосными им цилиндрическими выточками для крепления двух независимых фотоприемников - фотоэлектронных умножителей (4). На
оптическом пути от анализируемой пробы к каждому из ФЭУ в структурной связи с боковыми окнами находятся перпендикулярно расположенные по отношению к ним щели (5), позволяющие размещать в них светофильтры (6), вычленяющие из световых потоков отдельные части спектра, соответствующие максимумам световой эмиссии для каждой из регистрируемых реакций генерации свечения: хемилюминесценции или биолюминесценции.
Конструкция кюветного отделения также предусматривает наличие светоизолирующей крышки (на чертеже не указана), исключающей попадание внешнего света на анализируемую пробу, светофильтры и далее на ФЭУ.
Описанная выше механическая связь между структурными элементами предлагаемой полезной модели дополняется передачей данных об интенсивности регистрируемого свечения с каждого из ФЭУ через систему независимых усилителей на электронные сопрягающие устройства и далее на ПК.
Осуществление полезной модели.
Полезная модель работает следующим образом:
1) кюветное отделение подсоединяется к двум независимым фотоэлектронным умножителям с системой обработки сигнала и его передачи на ПК;
2) в щели, расположенные перед ФЭУ помещаются светофильтры с неидентичными полосами пропускания, соответствующими максимумам световой эмиссии регистрируемых реакций генерации свечения - хемилюминесценции и биолюминесценции (например 425±5 нм и 495±5 нм);
3) в темновую камеру кюветного отделения помещается пробирка с пробой, содержащей все компоненты для генерации свечения в результате реакций хемилюминесценции и биолюминесценции;
4) кюветное отделение закрывается светоизолирующей крышкой, предотвращающей попадание внешних источников света на анализируемую пробу, светофильтры и далее на ФЭУ;
5) после подключения прибора к электрической сети проводится измерение интенсивности свечения в анализируемой пробе в двух различных неперекрывающихся частях спектра с использованием двух независимых ФЭУ;
6) сигналы с ФЭУ, прошедшие через систему независимых усилителей преобразуются на едином устройстве сопряжения и поступают на ПК, где происходит их количественная регистрация и оценка;
7) прибор отключается от сети, светоизолирующая крышка снимается, анализируемая проба извлекается из кюветного отделения, после чего на ее место помещается другая, после чего весь цикл с п.4 повторяется.
Таким образом, основным техническим результатом, формирующимся в результате использования полезной модели, является одновременная (в том числе в кинетическом режиме) регистрация интенсивности хемилюминесценции и биолюминесценции в одной анализируемой пробе.
Пример.
Полезная модель, в частности, может использоваться при осуществлении метода оценки фагоцитоза. Так представления об интенсивности «окислительного взрыва» нейтрофильных фагоцитов могут быть получены на основе анализа интенсивности свечения добавляемого в пробу люминола, при окислении до аминофталевой кислоты испускающего свет с максимумом эмиссии при 425 нм. С другой стороны, представления о результатах воздействия нейтрофильных фагоцитов в отношении бактериальных клеток-мишеней могут быть получены при использовании в качестве последних рекомбинантных микроорганизмов с клонированными генами биолюминесценции. При этом интенсивность падения биолюминесценции с максимумом при 495 нм является пропорциональной числу жизнеспособных клеток и на этой основе может использоваться для оценки развивающегося в отношении них киллингового эффекта.
Однако, использование известных из уровня техники кюветных отделений и снабженных ими биохемилюминометров обычной конструкции не позволяет провести одновременную раздельную оценку интенсивности хемилюминесценции и биолюминесценции в одной анализируемой пробе, т.к. используемые в них технические решения ориентированы на регистрацию суммарной интенсивности свечения во всем видимом диапазоне спектра (обычно от 350 до 800 нм). В этой связи для раздельного учета интенсивности хемилюминесценции и биолюминесценции в фагоцитарной системе приходится проводить исследование интенсивности свечения как минимум в двух пробах: 1) фагоциты + люминол + обычные (нелюминесцирующие) бактерии для оценки интенсивности хемилюминесценции и расчета на этой основе параметров активации фагоцитов; 2) фагоциты + рекомбинантные люминесцирущие бактерии для оценки биолюминесценции и расчета на этой основе параметров киллингового эффекта.
Использование заявляемой полезной модели позволяет устранить эти недостатки, так как при ее осуществлении возможна одновременная раздельная оценка хемилюминесценции и биолюминесценции в одной анализируемой пробе, содержащей
все компоненты для данных реакций генерации свечения: фагоциты + люминол + рекомбинантные люминесцирущие бактерии. При этом учет интенсивности хемилюминесценции осуществляется первым из используемых ФЭУ, излучение к которому проходит через расположенный перед ним светофильтр с полосой пропускания 425±5 нм, соответствующей максимуму испускания люминола при его окислении до аминофталевой кислоты. С другой стороны, учет интенсивности биолюминесценции осуществляется вторым ФЭУ, перед которым расположен светофильтр с полосой пропускания 495±5 нм.
Указанная особенность позволяет осуществлять значимое для получения конечного результата разделение интенсивности свечения в двух неперекрывающихся диапазонах длин волн, соответствующих максимумам световой эмиссии реакций хемилюминесценции и биолюминесценции, что создает новые возможности для исследований и существенно сокращает суммарное время их проведения. Кроме того, предлагаемая конструкция кюветного отделения создает возможности для кинетического анализа хода ферментативных и биологических реакций, сопровождающихся генерацией свечения в двух различных (неперекрывающихся) диапазонах длин волн.
1. Кюветное отделение для биохемилюминометра, имеющее темновую камеру для размещения исследуемой пробы с подключенной к ней системой регистрации световых импульсов, отличающееся тем, что темновая камера имеет два независимых выхода для сопряжения с двумя отдельными фотоприемниками (фотоэлектронными умножителями), перед каждым из которых расположены щели для светофильтров с неидентичными (непрекрывающимися) полосами пропускания.
2. Устройство по п.1, отличающееся тем, что перед одним из фотоэлектронных умножителей установлен светофильтр с полосой пропускания 425±5 нм, соответствующей максимуму хемилюминесценции люминола, а перед вторым - с полосой пропускания 495±5 нм, соответствующей максимуму бактериальной биолюминесценции.
