Субстрат для закрепления бактерий и способ получения неспорообразующих бактерий рода рsеudомоnаs

 

()981358

Союз Советски и

Социалистическии

Республик

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61 ) Допол н и тел ьное к а вт. с вид- ву (22) Заявлено 22. 09.81(21) 3258386/28-13 (51) М. Кл. с присоединением заявки №

С 12 М 1/04

Гааудвратаеиый камитет

СССР (23) Приоритет

ОпУбликовано 15.12.02. Бюллетень № 46 да делам изабретеиий и атирытий (53) УДК 576 (088,8) Дата опубликования описания 17 . 12 .82

В.П. Тульчинская, Г A. Кожанова, Т.Q. Беляева, .

Т.В. Васильева и Л.A. Калмазан

Одесский ордена Трудового Красного Знамени государственный университет им. И.И. Мечникова (72) Авторы изобретения (71) Заявитель (54) СУБСТРАТ ДЛЯ ЗАКРЕПЛЕНИЯ БАКТЕРИЙ

И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НЕСПОРООБРАЗУЮЩИХ

БАКТЕРИИ РОДА РБЕИООМО11А5

Изобретение относится к микробио логии и методам хранения микроорганиз. мов, предназначенных для очистки загрязненных вод.

Известен субстрат для закрепления спор актиномицетов, содержащий песок в смеси .с почвой ll j.

Недостатком указанного субстрата является то, что он предназначен для хранения спор и не пригоден для ад10 сорбции клеток неспорообразующих бактерий, например, рода Pseudomonas без предварительной лиошилизации.

Известен субстрат для закрепления споровых бактерий ТН1оЬас PPus ferrokiс тацз, содержащий песок в смеси с пиритом (2 7.

Однако этот субстрат также не пригоден для хранения неспорообразующих бактерий. го

Известен также способ получения и хранения неспорообразующих бактерий, предусматривающий адсорбцию микроорганизмов в дисперсном субстра2 те, согласно которому лио6илизированные клетки бактерий адсорбируют на гранулах пемзы C 3 ).

К недостаткам данного способа сле" дует отнести необходимость использования специальной. дорогостоящей аппаратуры для диойилизации культур бакте" рий. Для некоторых культур хранение в диопилизированном состоянии HB гранулах пемзы не превышает 6 мес, что недостаточно.

Цель изобретения - упрощение способа и удлинение сроков сохранения биохимической активности неспорообразующих бактерий рода Pseudononas.

Поставленная цель достигается тем, что субстрат для закрепления бактерий, содержащий песок, дополнительно содержит рыбную муку при соотношении компонентов, eec.i:

Рыбная мука 80-85

Песок 15-20 а такие тем, что согласно способу получения неспорообразующих бактерий

3 98135 рода Pseudomonas, предусматривающему адсорбцию микроорганизмов в дисперсном субстрате, адсорбцию осуществляют в процессе культивирования бактерий с субстратом, в качестве которого используют смесь рыбной муки с песком, взятых в соотношении 4:1 - 5,7:1, внесенного в среду в количестве 104 с последующим отделением адсорбированной биомассы, промыванием ее стерильным 1ð физиологическим раствором И помещением в стерильный 0,8-1,0i-ный раствор хлористого натрия при соотношении биомассы и раствора 1:8-1:10.

Пример 1. Осуществляют за- 13 крепление на субстрате и получение и хранение штамма бактерий деструкторов

Ps. aeruginosa КИ, способных разрушать органические красители и предназначенные для очистки сточных вод высокой цветности.

В качестве субстрата для закрепления бактерий применяют рыбную муку, промытую в течение суток проточной водой и прокаленную при 200 С в те- 33 чение 4-х часов. Обработанная таким образом мука представляет собой порошок коричневого цвета. Для предупреж дения комкования муку смешивают с песком, который подвергают аналогичной предварительной обработке. Песок и рыбную муку смешивают при следующем объемном соотношении компонен" тов, I: мука 80; песок 20. Для одного опыта берут 40 смз муки и 10 см

35 песка, Суточную агаровую культуру бактерий в дозе 500 млн клеток/мл вносят в минеральную среду И-9 следующего состава, г: калий фосйорнокислый однозамещенный 3,0; аммоний хлористый

1,0, вода дистиллированная 1000 мл. рН среды устанавливают добавлением

101 раствора кальция гидрата.

В минеральную среду дополнительно вносят субстрат для окисления — крафЯ ситель кислотный черный С в концентрации 25 мг/л. Субстрат для адсорбции бактерий вносят в минеральную среду указанного состава в количестве

10 об.Ф, т.е. в опыте к 300 см3среды добавляют 30 см субстрата.

Адсорбцию культуры на субстрате осуществляют в процессе культивирова.ния в течение 48 ч при 30ОС. Затем, закрепленные на субстрате клети бактерий отмывают дважды стерильным физиологическим раствором, .после чего субстрат с закрепленными клетками пере8 4 носят в 8 пробирок размером 25 х х1,,5 см в количестве 3 см и заливают 24 смЗ стерильного 0,8i-ного раствора хлорида натрия (объемные соотношения субстрата и раствора 1:8 ).

Культуру хранят при +4 С и при комнатной температуре, По истечении определенных сроков хранения (6,9, 12 и 24 мес ) изучают жизнеспособность и деструктивную активность штамма Ps. aeruginosa KM.

Проверку жизнеспособности и деструктивной активности бактерий после хранения в условиях периодического культивирования осуществляют следующим образом, Для реизоляции бактерий после хранения субстрата с закрепленными клетками промывают 3 раза стерильным .физиологическим раствором, растирают в стерильной ступке, а затем используют, как инокулят при посеве в минеральную среду М-9. После культивирования в течение 48 ч при 30 С производят рассев на поверхность мясо-пептонного arapa в чашках Петри для выделения чистой культуры.

При проверке окислительной (деструктивной ) активности бактерий используют суточную агаровую культуру, которую в дозе 500 млн. к-к/мл вно сят в минеральную среду M-9, содержащую загрязняющее вещество — краситель кислотный черный С в концентрации 100 мг/л.

Иикробиологическое окисление осуществляют в процессе периодического культивирования при 30 C в течение

48 ч в стационарных условиях.

Результаты деструкции учитывают методом фотоэлектроколориметрии на

ФЭК-56 при М = 750-760 мм (красный светофильтр ) после осаждения микробных клеток центрифугированием при

4 тыс. об/мин в течение 8 мин.

Культура бактерий Ps. aeruginasa

KM после 6, 9, 12 и 24 мес. хранения независимо от температурного режима сохраняет способность к росту в минеральной среде М-9 и вызывает 981001-ную деструкцию красителя кислотного черного С (таблица).

Пример 2. Осуществляют закрепление на субстрате и получение и хранение штамма бактерий деструкторов Ps. fluorescens 2 .

Обработку рыбной муки и песка осуществляют как указано в примере 1.

5 9И13

Муку и песок смешивают при следующем объемном соотношении компонентов, 4: мука 85;.песок 15. Для опыта берут 43 смЗ и 8 см З песка.

Суточную агаровую культуру бактерий в дозе 500 млн к-к/мл вносят в минеральную среду М-9, в которую дополнительно вводят субстрат для окисления - краситель кислотный черный С в концентрации 75 мг/л. о

Адсорбцию культуры на субстрате

:осуществляют как указано в примере 1, Хранение осуществляют в 8 пробирках под слоем стерильного 1,0i-ного раствора хлорида натрия при объемном 5 соотношении субстрата и раствора

1:10/3 см субстрата заливают 30 см раствора хлорида натрия, при +4 С о и при комнатной температуре.

По истечении определенных сроков 20 хранения (6, 9, 12 и 24 мес) изучают жизнеспособность и деструктивную активность штамма Ps. fFuorescens 2, vBK указано B примере 1 (загрязнитель - краситель кислотный черный С в концентрации 75 мг/л ).

Культура бактерий Ps. fPuorescens

2 после 6, 9, 12 и 24 мес хранения независимо от температурного режима сохраняет способность к росту в мине-ЗО ральной среде M-9 и вызывает 90100 -ную деструкцию красителя кислотного черного С в концентрации 75 мг/л, Пример 3. Осуществляют закрепление на субстрате и получение ss. и хранение штамма бактерий деструкторов Ps. species 6, предназначенных для очистки от формальдегида сточных вод химических производств.

Обработку рыбной муки и песка осу-ео ществляют, как указано в примере 1.

Муку и песок смешивают при следующем объемном соотношении компонентов,l: мука 82,5; песок 17,5. Для опыта берут 41 см муки и 9 см песка. is

Суточную агаровую культуру бактерий в дозе 500 млн к-к/мл вносят в минеральную среду M-9, в которую дополнительно вводят субстрат для окисления - формальдегид в концентрации sg ,100 мг/л.

58 6

Адсорбцию культуры на субстрате осуществляют как указано в примере 1, Хранение осуществляют в пробирках под слоем стерильного 1,0 -ного раствора хлорида натрия при объемном соотношении субстрата и раствора 1:9/

/3 см субстрата и 27 см раствора хлорида натрия при +4 С и при комо натной температуре.

По истечении определенных сроков хранения изучают жизнеспособность бактерий, как указано, и деструкцию формальдегида в концентрации 500 мг/л колориметрическим методом с применением хромотроповой кислоты.

Птамм Ps. species 6 после 6, 12 и 24 мес хранения независимо от температурного режима сохраняет спо" собность к росту в минеральной среде

М-9 и вызывает 95-1001-ную деструкцию формальдегида.

Схема опыта и сроки хранения биохимически активных бактерий представлены в таблице.

Т.е. на примере 3 штаммов бактерий деструкторов рода Pseudomonas установлено, что после 24 мес хранения пред-. лагаемым способом на новом субстрате бактерии сохраняют высокую окислительную активность, что позволяет использовать их для микробной очистки водной среды от токсикантов-загрязнителей после длительного хранения, Предлагаемое изобретение обуславливает социальный эййект, так как упрощает процесс хранения микроорганизмов.

Возможность использования бактерий для микробной очистки водной среды от токсикантов-загрязнителей после длительного хранения обусловливает экологический эффект в аспекте борьбы за

1 охрану окружающей среды.

Таким образом, реализация изобретения позволяет длительно хранить неспорообразующие бактерии рода Pseudomonas, используя упрощенный способ хранения и обеспечить сохранение их биохимической активности.

С> О

CO

С4

1 О

Iv

oz u

III В

z X

o +

К В X стх

f1 в с о v

ХОС УY

aО

Um0

IQ CL L

» х 0

o > х

4.Э !

v >z

z л х z

v

X х

Р с

Э

1о

flI

Q.

bC т N в

1- >z

X З о

Y о о

Е хо

1- о ос а

X

X а в

1х

>О

CL

>f>

»>

>}.

Э В

1 3

Х 1 3. Z

В I В 1 е i#8 а!о о х а ffI

1О О сС

О CIS

v1 I-a о! ио

<> I CL X

z о l>О

Ic а

z lCO

°

К

X ак

1fg

CO

С>

C) о

s и ю о

orna

vs1CC Z fD ю <О а

1- 1K CL o

z OI0

CIО» о а о

u s <О

»xz

X

=т

ffI

X с

Q;

f1I

Р с в !

>О

X с

z а х

cc a в о о

>О

m s o с,> М сч л

CO д,р д,р

Ln an

CO °

Ж оМ оо

Ф cV а s

=1 1> х е о

Y u

» в

Е с х о о

Y

>О О х о

» в

Е с (О

2 е с

Vt0 S

I0az

»О III и о

Е 1: с а а 1е о

Е 1О а а

C: L с

l» о

Iо

O. с сч с

1о

1о а

О. е

X а с

C} в

s

CL с

I I в о

z c

fII

a m х е ю о > а s о т у о о а

Е

l Y

III

Х о >z

s o

I0 Х о е а т в х

1- X е

З

Y

1 о

z т о о с о

z

fII

L о о о о

>.> е

О

C о

Д е

М. 981358 о»>

Э Л о»> о е

° — î v

v v oо .О О о а а м Э °вЂ” о и о а о

° ° ° о а. cL cL . Л! и 3 т а о е

C а* III 0 оах

Эхо

X lII

ыvc

З а о

I Y

» а а

I- fII о с а в е»>

1- CL х

f1I из а

X:

ffI

»> о с

О>

:р

1в

fII

>f>

tf>

:1 в

If> е

1о

Рй

Ч>

2l

z а в г т с

>5 1

Б

1О л с с(s

Е в с

С(W

Р с и !

О

1 о ао

o an е—

Формула изобретения

9813

1. Субстрат для закрепления бактерий, содержащий песок, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью удлинения сроков хранения неспорообразующих бактерий рода Pseudomonas субстрат дополнительно содержит рыбную муку при соотношении компонентов, вес. ". о

Рыбная мука 80-85

Песок 15-20

2. Способ получения неспорообразующих бактерий рода Pseudononas, предусматривающий адсорбцию бактерий в is дисперсном субстрате, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью упрощения способа и удлинвния сроков сохранения биохимической активности бактерий рода Pseudomonas, адсорбцию осу- щ ществляют в процессе культивирования бактерий с субстратом, в качестве ко58 10 торого используют смесь рыбной муки с песком, взятых в соотношении 4:1.5,7:1, внесенного в среду в количестве 103 с последующим отделением адсорбированной биомассы, промыванием ее стерильным физиологическим раствором и помещением в стерильный 0,81,04-ный раствор хлористого натрия при соотношении биомассы и раствора

1;8-1:10.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Методы хранения коллекционных культур микроорганизмов. М., "Наука", 1967 141-144.

2. Авторское свидетельство СССР . no заявке 2781918/28-. 13, кл. С 12 М 1/00, 1979.

3.. Juven В.I. А simple method for

long-termpreservation of stock cultures of lacti acid bacteria. рр1. Bacteriol., 1979, 47, и 9.

Составитель Е. Воробьева

Редактор А. Гулько TexpeQ О.Неце Корректор С. Некмар

Заказ 9633/36 Тираж 505 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

1130Я Москва И-35 Раушская наб. д. 4/$

«аа А- - »««Л - 5«4 « - - 4

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4