Способ количественного определения циклических нуклеотидов

Авторы патента:

G01N33/48 - биологических материалов, например крови, мочи (G01N 33/02-G01N 33/14,G01N 33/26,G01N 33/44,G01N 33/46 имеют преимущество; определение всхожести семян A01C 1/02); приборы для подсчета и измерения клеток крови (гемоцитометры) (подсчет клеток крови, распределенных по поверхности, путем сканирования этой поверхности G06M 11/02)

Союз Советских

Социалистических

Республик

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ()972402 (6l ) Дополнительное к авт. свнд-ву (22) Заявлено 27.04.81 (21) 3282265/28 13 с присоединением заявки № (23) Приоритет

Опубликовано 07.11.82. Бюллетень №41

Дата опубликования описания 07. 1 1. 82 (51)М. Кл.

G,01 М 33/48 еооударотаенный комитет

СССР во делам нзооретеннй и открытий (53) УДК 547 8 (088. 8) -".; (, .i «ig

А. П. Хохлов, В. К. Малаховский, Т. Н. Ненао ева и B. С. Коноплев . i- i т i Q

" Ф

i i.,; Öß ; 1 i.°.

$j,Ð ", )fj т. 1, (72) Авторы изобретения

-1-ый Московский ордена Ленина и ордена Трудового ра

Знамени медицинский институт им. И. М., Сеченова (7I ) Заявитель (54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Ш4КЛИЧЕСКИХ НУКЛЕОТИДОВ

Изобретение относится к медицине и биологии и предназначено для идентификации циклических нуклеотидов в биологических жидкостях и тканях.

Известен способ количественного определения циклических нуклеотидов в биологичаеком материале путем экстракции пробы спйртом, высушивания экстракта, растворения осадка в буфере, инкубации пробы при 0 С в црисугствии связываюо

1О щего белка и меченого нуклеотида, филь рования, отмывания несвязавшейся метки с последующим радиометрическим измерением количества циклических нуклеотидов (1) .

Однако известный способ длителен по времени анализа.

11ель изобретения вЂ” ускорение способа.

Поставленная цель достигается тем, что при осуществлении способа количественного определения циклических нуклеотидов в биологическом материале путем экстракции пробы спиртом, высушивания экстракта, растворения осадка в буфере, инкубации пробы при 0 С в присутствии связывающего белка и меченого нуклеотида, фильтрования, отмывания несвязав шейся метки с последующим радиометрическим измерением количества циклических нуклеотидов, инкубацию пробы проводят непосредственно на участке милипорового фильтра, покрытого гидрофобным материалом.

Способ осуществляется следующим образом.

Пример 1. Определение содержания циклического

3 5-аденозинмонофосфата (цАМФ) в ткани скелетных мышц больного миопатией

Дюшена.

Биопта г мьппечной ткани немедленно погружают в жидкий азот, затем гомогенизируюг в 3-5 мл кипящего этанола, центрифугируют при 5 000 об/мин 15 мин, упаривают досуха при 40оС. Осадок растворяктг в 0,5 мл буфера, содержаше072402

Стандарты, Ск, пк моль/мл, 1,25

1095 1055

717 677

464 424

1250 1210

2,0

3,11

497

Образец Сх

1,74

ro 5 мМ трис- НСЕ, 0,4 мМ ЭДТА, рН 7,4. 15 мкл исследуемого образца переносят на гидрофобное покрытие милипорового фильтра, добавляют 15 мкл

Н цАМФ и 30 мкл цАМФ-связывающего белка. Инкубируют 30-45 мин при 0 С.

Затем фильтры промывают хододным буферным раствором, содержащим 5 мМ

КН РО4 и 0,5 мМ ЭДТА рН 7,4; высушивают, помещают в толуольный сцинтил- щ лятор и измеряк г уровень радиоактивности HB сцинтилляционном счетчике.

В таблице приведен расчет содержания ll/ÀÌô.

Содержание цАМФ в образце опреде(со лязг по формуле â€” вЂ” 1 К. сх

Коэффициент К (тангенс угла наклона)

К=, =4

Сл. содержание цАМФ: (вЂ” вЂ” 1) . 4= 2,96.

1108

1150

В пересчете на мг белка, содержаше- 25 гося в пробе, концентрация цАМФ составила 3,52 пкмоль. При определении концентрации цАМФ известным способом расчеты проводятся аналогично и содержание нуклеотица в данном образце соста- ЗИ вило 3,7 пкмоль/мг белка.

Пример 2. Определение содержания циклического 3 5гуан озинмонофосфата

35 летных мьшш больного боковым амиогрофическим склерозом.

Экстракцию цГМФ проводят так же как цАМФ. Затем 30 мкл исследуемого образца переносят на т.идрод .,бное покры тие милипорового фильтра, добавляют 15 мкл Н цГМФ и 15 мкл антисыворотки.

Каплю инкубируют 30-45 мин при 0-2 С. Дальнейшие операции аналогичны проводимым при определении цАМФ. Содержание нуклеотида рассчитывают стандартным методом. Концентрация цГМФ, определенная известным способом, сосгавила 1,56 пкмоль/мг белка, а предлагаемым способом-1,61 пкмоль/мг белка.

Использование предлагаемого способа позволяет без снижения точности умень/ шить количество используемых реактивов и тем самым снизить стоимость анализа в 3-4 раза. Одновременно сокращается время проведения анализа и трудоемкость оп ер аций.

2 1726 1686

Ф ормула изобретени:-.

Способ количественного определения циклических нуклеотидов в биологическом материале путем экстракции пробы спиртом, высушивания экстрактa, растворения осадка в буфере, инкубации пробы при 0 С в присутствии связывающего белка и меченого нуклеотида, фильтрования, отмывания несвязавшейся метки с последуюшим радиометрическим измере.вЂ”. нием количества циклических нуклеотидов, о т л и ч а ю ш и и с я тем, что, с целью ускорения способа, инкубацию пробы проводят непосредственно на участке милипорового фильтра, покрытого гидрофобным материалом. !

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Балденков Г.Н. Изучение механизмов регуляции активности аденилатциклазы гормонами.,Канд. дис. М., МГУ, 1 979.

ВНИИПИ Заказ 8507/35 Тираж 887 Подписное

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Способ количественного определения циклических нуклеотидов

Способ определения активности полиеновых антибиотиков // 972400

Способ определения активности общих эстераз в биологическом материале // 972399

Способ определения жизнеспособности сердечной мышцы в условиях гипотермии // 972314

Способ приготовления препарата живого нейрона беспозвоночного животного // 972311

Способ диагностики недостаточности кровообращения при остром инфаркте миокарда // 967473

Способ определения 1-амино-4,8-дисульфокислоты нафталина мононатриевой соли в биологических жидкостях // 966594

Способ определения барбитуратов в биологических жидкостях // 964532

Способ выявления лимфоидной ткани слизистых оболочек на гистологическом препарате // 964522

Способ определения анальгетической активности лекарственных препаратов // 962814

Способ контроля состояния сельскохозяйственных и пищевых веществ или лекарственного препарата и устройство для его осуществления // 2100805

Способ определения в пробе цельной крови распределения вероятностей в популяции эритроцитов их подмножеств и устройство для его осуществления // 2100807

Способ определения гетероциклических нитросоединений в биологическом материале // 2100808

Способ выявления лимфоидных узелков в тотальных анатомических препаратах // 2101699

Изобретение относится к медицине, а именно к анатомии, топографической анатомии, патологической анатомии и может быть использовано для изучения лимфоидных узелков в тотальных анатомических препаратах макромикроскопическом поле видения в норме, в возрастном аспекте, в эксперименте и патологии

Способ ионного парамагнитного резонанса на нервном волокне // 2101700

Изобретение относится к медицине, в частности к способам неинвазивной диагностики функционирования биологических мембран и соответствующей оценке метаболических процессов в организме на клеточном уровне

Способ прогноза хронического рецидивирующего течения заболевания у лиц, перенесших первичную рожу // 2101701

Изобретение относится к медицине, а именно инфекционным болезням и дерматологии, и может найти применение как в стационарных, так и поликлинических условиях

Способ определения реактивного лизиса клеток // 2101702

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской биохимии, и может быть использовано для определения реактивного лизиса клеток в содержащей комплемент биологической жидкости в клинической практике и в научных исследованиях

Способ определения наличия активности воспалительного процесса при ревматоидном артрите // 2101703

Изобретение относится к медицине и предназначено для оценки активности воспалительного процесса при ревматоидном артрите путем биохимического исследования сыворотки крови

Способ дифференциальной диагностики миокардита и миокардитического кардиосклероза // 2102749

Устройство для локального подведения биологически активных веществ // 2102750