Способ конструирования штаммов еsснеriснiа coli-продуцентов рестриктазы и метилазы е со r @

(72) Авторы изобретения

В. Г. Косых, Я. И. Бурьянов и А. А. Баев

Институт биохимии и физиологии икроорганизмов

АН СССР (7l } Заявитель (54) СПОСОБ КОНСТРУИРОВАНИЯ ШТАММОВ

ESCHERIÑHlÀ С01Д вЂ” ПРОДУОЕНТОВ РЕСТРИКТАЗЫ

И МЕТИЛАЗЫ Е со R II

ИзоБретение относится к микробио-. логической промышленности и представ." ляет собой способ конструирования штаммовф с1агichia coll, несущих плазмиду с генами рестриктааы и метилазы

Е co R II.

Известны высокоспецифические рестрикционные эндонуклеазы и модицирую-. щие метилазы, которые широко используются для физического картирования хромосом, определения первичной структуры ДНК, выделения генов, а также в экспериментах по генетическому конст,руированию in vitro.

ts

Микробная клетка содержит в себе многочисленные как экэо-. и эндонук", :леазы, так и модифицирующие метилаэы.

Ферменты рестрикции - модификации

E co R Il относятся к разряду эндо- щ .нуклеаз и метилаз.

Известен способ конструирования штаммов-продуцентов таких ферментов, заключающийся в том,что плаэмиду с r å- .

2 нами рестриктазы и метилазы Е co R П путем коньюгации переносят в штамм

Escheric&a coli. Таким образом получают штаммы продуценты ферментов

E co R II ) l g.

Однако полученные таким образом штаммы содержат интерферирующие ферментативные примеси. Поэтому обнаружение и выделение ферментов E co R II на фоне других внутриклеточных интер" ферирующих ферментативных активностей весьма затруднено.

Цель изобретения - повышение штаммов - продуцентов, не содержащих интерферирующих ферментативных прьюе сей.

Дпя достижения цели используют штамм Escherichia coli. В 834, а в качестве плазмиды используют плазми-. ду М 3 или R 245.

Втамм Е. coli В 834 (r, пВ) не содержит ни рестрикционной эндонук.леазы Е со В, ни модифицирующей метилаэы Е со В, ни ДНК-цитозин-метилаэы, 3 94142 характерной для штамма E. coli HB1100 . I2j.

По предлагаемому способу были получены 2 штамма.

Штамм Escherichia coli В 834 (г, л!1 ) /R 245 характеризуется следующймй признаками.

Морфологические признаки. Клетки прямые палочковидной формы (1,1

1,5) к (2,0 - 6,0) мк, подвижные с 0 перитрихиальными жгутиками, грамотрицательные, неспороносные.

,Куль тура ль ные и риз на к и. Хорошо растут на простых питательных средах. При росте на мясо-пептонном агаре, пи- 15 тательном агаре "Дифко", минимальном агаре Девиса с глюкозой и казаминовыми кислотами колонии гладкие, круглые, прижатые, блестящие, серые, край ровный, мутные (на синтетических сре- щ дах — более слизистые и мутные) . При росте в жидких средах: мясо-пептонном бульоне, бульоне Дифко",.минимальной И9 с глюкозой и казаминовыми кислотами образуют ровную, интенсивную муть.

Физиолого-биохимические признаки.

Растет в йределах 4-45 С при оптимум рН 6,8-7,5.

В качестве источника углерода используют многие углероды, спирты, органические кислоты, в частности d-глюкозу, d-фруктозу, сахарозу, арабинозу, ксилозу, лактозу, трогалозу. Не усваивает ацетат, аданит, галактозу. В средах с глюкозой активно пьдкисляет с образованием газа.

В качестве источника азота используют как минеральные .соли в аммонийной и нитратной форме, так в органической форме в виде пептона, аминокислот, Нитраты восстанавливает до нитритов. Желатину не разжижает, Уреазйая активность не обнаруживается.. @идол не образует..

Устойчивость к антибиотикам. Про являет устойчивость к тетрациклину (30 мкг/мл) .

Штамм Escherichia coli В 834 (r, m )/N 3 характеризуется теми же морфо->о

Ь логическими, культуральными и физиологобиохимическими признаками.

Устойчивость к антибиотикам. Проявляет устойчивость и стрептомицину (30 мкг/мл),, сульфаниламиду (250 мкг/мл), и тетрациклину (30мкг/мл)

Пример 1. -В 100 мл мясо"rieri- .

:тонного бульона вносят 1мл культуры

3 4

Е. coli В 834 и выращивают до плотности 0,4 (ФЭК, светофильтр 6, кювета

0,5 см). После охлаждения клетки собирают центрифугированием и ресуспендируют в равном объеме 10 мИ NaC1, После 20-минутной инкубации во льду клеткисобирают центрифугированием и ресуспендируют в 1/2 объема 75мИ

СаС8 ». Клети инкубируют 20 мин и вновь собирают центрифугированием.

Осадок ресуспендируют в 1 мл 75 мМ

Са СРа.

К 0,2 мл суспензии полученных клеток добавляют 0,1 мл ДНК плазмиды

R 245, инкубируют во льду 20 мин.

Затем смесь подвергают 2- минутной обработке при 42 С и выдерживают

15 мин при 24 С. Смесь разбавляют в

10 раз бульоном, подращивают клетки

30 мин при 37 С, отбирают на 0,1 мл суспензии и высевают на чашки с питательным агаром, содержащие 30мкг/мл тетрациклина. Выросшие клеткиЕ. coli

В 834 (г-, т )/R 245 растят до позд",е ней логарифмйческой фазы в питательном бульоне "Дифко". Клетки собирают центрифугированием 6000 g, до 20 мин и ресуспендируют в буфере следующего состава: 0,01 м K-РО4, рН 7,01 мИ:

ЭДТА, 7 мИ 2-меркаптоэтанол, 5l глицерин. Клетки разрушают ультразвуком.

После разрушения центрифугируют

100000 g, 1 ч при 4 С. Бесклеточный, экстракт содержит ферментативную активность.

Пример 2. Трансформируют плазмиду N B штамм E. coli В 834 (r, в-) и получают бесклеточный экстракт из сконструированного штамма Е. coli В 834 (rz, m )/N 3 аналогично описанному в примере 1.

Определение активности ДНК-метилаз.

Активность метилазы определяют в реакционной смеси общим объемом !

50 мкл, содержащей 40 мИ К-РО, рН 7,8, 1 мМ ЭДТА, 7 мИ 2-меркаптоэтанол, 20 мкг ДНК спермы лосося, 4 мкИ/метил-3Н/S — аденозилметионина и 50 мкл бесклеточного экстракта.

Реакцию проводят при 37 С в течение

1 ч, добавляют равный объем 0,75 N едкого натра, инкубируют 30 мин при

60 С. Затем к пробам добавляют 2 мл холодной 53-ной трихлоруксусной кислоты. Осажденную ДНК наносят на фильтры, промывают 0,01 N НС1 и спиртом.

После просушки фильтров определяют радиоактивность.

5 941 4

Для определения специфичности включения метки в азотистые. основания

ДНК последнюю элюируют с фильтров, гидролизуют до азотистых. оснований

57/-ной хлорной кислотой и основания разделяют хроматографией на бумаге.

Определяют местоположение оснований на хроматограмме в проходящем УФ-све те, вырезают "пятна", соответствую щие разным основаниям и определяют 1О ! в них радиоактичность.

Формула изобретения

Способ конструирования штаммов

Escherichia coli — продуцентов рестриктазы и метилазы Е co R II, вклю23 6 чающий трансформацию плазмиды, имею." щей гены рестриктазы и метилазы

Е со R П, в клетки:Escherichia со

li, отличающийся тем, что, с целью получения штаМмов- продуценТо8 не содержащих интерферирующих ферментативных примесей, используют штамм Escherichia coli В 834, а в качестве плазмиды используют плазми ду N 3 или R 245.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

Бурьянов Я. И. и др. ДАН СССР„, 1 977» т. 237 Н 2, с. 465-468.

2. Wood Х. В., J Мо1. Б1о1, v. 16, 1966 р. 118-133, Составитель Т. Тулякова

Редактор Л. Алексеенко Техред А. Ач

КО юектоo M° . Пожо рюе р»

3. 3

Подписное

Заказ 4763/9 Тираж 505

ВНИИПИ Государственного комитета ССССР по делам изобретений и открытий

«ll)0)g» Москва Ж-Я Раушская наб. g» 4Д

Филиал hllll "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4