Способ оценки качества спермы сельскохозяйственных животных

 

ОП ИСАНИЕ

ИЗЬВРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических республик (1938990 (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22)Заявлено 09 ° 06.80 (21) 2936645/30-15 с присоелинением заявки №(23) Приоритет

Опубликовано 30.06.82. Бюллетень № 24

Дата опубликования описания 30.06.82 (51)М. Кл.

A 61 О 7/02

3Ьсударстеениый комитет

СССР ио делам изобретений и открытий (53) УДК591.463..1(088.8) f t

Л. Г. Мороз, И.Q. Шапи е в и Н. В. Корбан, (72) Авторы изобретения

Всесоюзный научно-исследовательский институт разведения и генетики сельскохозяйственных. животных (71) Заявитель (54) СПОСОБ ОЦЕНКИ КАЧЕСТВА СПЕРМЫ

СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

Изобретение относится к искусственному осеиенению сельскохозяйственных жи вот ных, Известен способ оценки качества спермы сельскохозяйственных животных, включающий измерение дыхания клеток полярографическим методом в среде инкубации до и после добавления в среду 2,4 — динитрофенола Г13.

Состав среды инкубации в зависи,мости от вида клеток и целей определения различен. Обычно. применяют сложные многокомпонентные среды инкубации, в состав которых входят . редкие и дорогостоящие реактивы, Так для оценки замороженно-оттаянной спермы хряка использовалась среда за.мораживания ГХЦКУ, состоящая из глюкозы, хелатона, цитрата калия и

zo унитиола.

Для оценки устойчивости к замораживанию свежеполученной спермы этот способ не применялся. Присутствие в ГХЦКУ среде цитратов и унитиола, влияющих на дыхание, мешает оценке действия других веществ и делает невозможным применение предлагаемого способа для оценки свежеполученной спермы хряков.

Цель изобретения - отбор неповрежденной устойчивой к замораживанию спермы.

Пост а вле ниая цел ь дости гает ся тем, что дополнительно определяют целостность внешней клеточной мембра- ны сперматозоидов по реакции дыхания на янтарат калия.

Пример l. 3 - 5 мл .свежеполученной спермы через 1 ч после получения центрифугирулт в течение 10—

15 мин при 700 g. Плазму сливают и сперматозоиды ресуспендируют в таком количестве 0,25 М сахарозы, чтобы концентрация сперматозоидов суспензии составляла около 2 млрд. клеток на 1 мл. Дыхание суспензии спермато-, 38990

20

Ео

55

3 9 зоидов измеряют полярографически в ячейках объемом на 1 мл при помощи платинового электрода. В полярогра фическую ячейку вносят последовательно 0,9 мл 64-ой глюкозы, 0,05 - 0,j мл суспензии сперматозоидов, 0,0250,05 мл 0,20 M янтарнокислого калия и 0,025 ". 0,050 мл ДНФ в концентра" ции 10 И. Полярографическую запись проводят для эндогенного дыхания (V3j, после внесения добавок янтарной кислоты V><< и 2,4-ДНФ- М,н@ по 2 - 3 мин после каждой добавки.

По кривой дыхания рассчитывают отношение скорости дыхания с янтарнокислым калием к скорости эндогенного янк дыхания (---- и отношение скорости зн дыхания с 2,4 ДНФ к скорости дыхания хднф с янтарнокислым калием

Измерение скорости дыхания производят, определяя уменьшение тока в делениях шкалы самописца, либо в ммкА кислорода после расчета цены деления самописца.

Добавка субстрата дыханияянтарнокислого калия используется в качестве пробы на целостность мембран сперматозоидов.

Установлено, что использование в качестве среды инкубации 5,96,13 глюкозы и последовательное введение в среду янтарнокислого калия в концентрации 5 -. 15 мм и 2,4 ДНФ в конечно" концентрации 2,5 10 -5 -10 И дает возможность оценить проницаемость мембран и энергетическую систему сперматозоидов разных проб свереполученной спермы, так как при этом исключается влияние на дыхание присутствующих в ГХЦКУ среде цитратов и унитиола. Одновременно максимально упрощается среда инкубации (фиг.1).

На фиг.1 приведена полярограмма влияние янтарнокислого калия на дыхание сперматозоидов, инкубированных в ГХЦКУ среде и в 66-ой глюкозе.

Стрелками показаны моменты введения сперматозоидов (сп.) и добавок янтарнокислого калия и 2,4 ДНФ. В

63-ой глюкозе янтарнокислый калий усиливает дыхание и имеется высокая стимуляция дыхания 2,4-ДНФ. 9 . 8

ГХЦКУ среде янтарнокислый калий . не усиливает дыхание и ниже стимуляция дыхания 2,4-ДНФ.

Установлено, что в свежеполученные интактные сперматозоиды янтарнокислый калий не. проникает и не усиливает дыхание. Усиление дыхания имеет место в случае увеличения проницаемости мембран сперматозоидов при повреждении, например при температурном шоке (табл.1). Если в свежеполученной сперме имеет место усиление дыхания после добавления янтарнокислого калия, сперма не пригодна к замораживанию. Таким образом, проба на янтарнокислый калий увеличивает точность определения и позволяет сразу отбраковать сперму с нарушенной проницаемостью мембран.

Добавка 2,4-ДНФ после янтарнокислого калия позволяет оценить прочность регуляторных механизмов энергетической системы, При этом, чем выше стимуляция дыхания в сперме после добавления 2,4-ДНФ, тем она устойчивее к замораживанию (табл.2) .

На Фиг.2 приведены полярограммы:

Сперма пригодна к замораживанию— янтарнокислый калий не усиливает дыхание,янк/эн=1 и имеется высокая стимуляция дыхания 2,4-ДНФ фнф/VЯн„=

=4. tli .. Сперма не пригодна к замораживанию - не имеется стимуляции дыхания янтарнокислым калием, V g/

30 /Ч3н =1, но слабая стимуляция 2,4-ДНФ, Мднф/ рд1к =2,3. и . Сперма не пригодна к замораживанию, имеется стимуляция дыхания янтарнокислым калием 1/я,ж/Чщ ——

=1,4 и не высокая стимуляция дыхания

2 "- НФ Vp,нф/Чян =2.

Пример 2. Было исследовано дыхание и влияние на дыхание сперматозоидов 2,4-ДНФ 80 эякулятов от 11 хряков совхоза"Детскосельский".,После замораживания и оттаивания этих эякулятов проверена их оплодотворяющая способность. Установлена высокая и достоверная корреляция между величиной стимуляции дыхания 2.4-ДНФ в сперме и оплодотворяющей способностью этих эякулятов (r=0,71 при р(0,001

Из данных табл.3 следует, что, если,. стимуляция дыхания в свежеполученной сперме выше. 3,6-4,2, то оплодотворяющая способность > 603.

Предлагаемый способ оценки качества спермы имеет преимущества перед имеющимися способами оценки по активности, концентрации, устойчивости к температурному шоку, так как этот способ является более объективным, имеет графическую регистрацию результатов, является более точ

5 938990 6 ным (высокая связь с оплодотворяющеи ного семени и повысить оплодотворяеспособностью) и дает возможность быст- мость от осеменения замороженно-отро оценить сперму (время оценки, как таянной спермой ° что способствует и при определении температурного ускорению внедрения метода в 1 роизшока, составляет 10-15 мин). Вояст ВО °

Использование предлагаемого спо- Способ может быть использован соба позволит уменьшить затраты для оценки спермы при разработке разтруда на замораживание нерезистент- личных методов ее сохранения.

Т а б л и ц а 1

Влияние янтарнокислого калия на дыхание свежеполученных сперматозоидов и после температурного шока

Сперма Кол-во опытов

Скорость дыхания в ммкА ° 0 /мин

Чянк

Чзн

Ч нф нк

Vn,м р

1,0

3,1

Подвергнутая шоку

15 92i29,4 170+46,7 352+102,4 2,0

1,8

Таблица 2

Влияние 2,4-ДНФ на дыхание спермы подопытных хряков и ее оплодотворяющая способность после замораживания-оттаивания

С вежеполученная

Замороженнооттаянная

Хряк

Скорость дыхания в ммкА ° 0 /èè на 1 млрд.сп. 1Ф йячк ! оплодотворения

1,6 + 0,08

267 + 20,1 423 19 7

4

240 + 28,0

215 + 28,5

11,5

15,8

16,7

18,4

15,0

531 +

385 +

228 + 31,2 548 +

120 + 21,0 307

526 >

323 и

295 +

117 + 10,0

135 + 16,1

79 + 6,10

39,0

13,0

10

294 + 17,0

2 74+ 12;0

4 99+ 9,10

284 + 30,1

267 + 42,0

2,2+ 0,21

5 125 + 13,0

Свежеполученная 15 273":76,5 274+73,0 819>10?; 3

2,2 j 0,25

1,8 + 0,23

2,4 + 0,20

2,6 + 0,07

4,5 + 0,10

2,4 + 0,18

3,8 + 0,20

4,3 + 0,38

3,0 + 0,18

33,3

50,0

2\,3

14,3

50,0

76,9

35,7

80,0

85,7

39,о

12 5

Таблица 3

938990 а

Прогнозирование оплодотворяющей способности замороженно-оттаянной спермы хряков

Количество эякулятов

Оплодотворяющая способность эамороженнооттаянной спермы,Ф

1,6- 2,5

2,6 - 3,5

12,5 - 35,9

36,0 - 60,9

61,0 - 85,0

3,6- 4,5

Формула изобретения

Способ оценки качества спермы сельскохозяйственных животных, пре20 имущественно хряков, включающий полярографическую.. оценку энергетической системы сперматозоидов в среде инкубации по реакции дыхания на 2,4динитрофенол, о т л и ч а ю щ и й25 с я тем, что, с целью отбора неповКоэффи ци ент сти муля ции дыхания 2,4-ДНФ режденной устойчивой к замораживанию спермы, дополнительно определяют целостность внешней клеточной мембраны сперматозоидов по реакции дыхания на янтарат калия, Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Бюллетень ВНИИРГЖ, Л., 1978, вып. 33, с.28-30.

938990 роюосиомжи 8у/

Составитель А.филиппова

Техред 3. Кастелевич Корректор М.Шароши

Редактор А.Мотыль

Подписное

Филиал ППП "Патент", г.ужгород, ул.Проектная,4 е

Заказ 4526/12 Тираж 714

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Рауаская наб., д.4/5