Способ определения холестерина в биологических тканях

 

А.Ф. Мынка, Л.Е. Зарума и И.Л. Люта

1 .Ю

Ф

Львовский государственный медицинский;;, .-:,:. ;:,т;:: институт (72) Авторы изобретения (7l) Заявнтель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ХОЛЕСТЕРИНА

В БИОЛОГИЧЕСКИХ ТКАНЯХ

Изобретение относится к биохимии и может быть испс1пьзовано в медицине в клинической практике и лабораториях.

Известен способ определения холестерина в биологических тканях пу" тем обработки пробы реагентами с последующим измерением светопогло" щения полученной реакционной смеси f)J, Однако способ обладает недостаточно высокой чувствительностью.

Цель изобретения - повышение чувствительности способа.

Поставленная цель достигается тем, что способ определения холестерина в биологических тканях осуществляют путем обработки пробы реагентами с последующим измерением светопоглощения полученной реакционной смеси, из пробы экстрагируют липиды, экстракт подвергают исследованию методом инфракрасной спектроскопии в области 950-1200 см и по интенсивности поглощения в об2 ласти. 1065 см определяют концентрацию холестерина.

Способ определения холестерина осуществляется путем проведения гидролиза эфиров холестерина гидрооксидом калия, экстракцией его органическими растворителями (СС9, СНСР ), получения сухого экстракта, прессования его в пластинки с бромидом калия и измерении интенсивности поглощения полосы 9С-О в области 950-1200 см- . Концентрацию холестерина рассчитывают по формуле, выведенной на основании статистической обработки калибровочной кривой методом наименьших квадратов

С«и= (1) где 0 — оптическая плотность С-О;

0,017, 0.259 - коэффициенты,полученные в резуль" тате математичес. кой обработки калибровочной кривой.

Т а б л и ц а 1

0,0812

0,45

0,54

0,63

0,72

Ф р = 10/1, (2) 0,81

0,88

0,905

1,17

1,19

1,35

0,3554

1,44

Для получения калибровочной кривой готовят серию смесей, содержащих точно взвешенное количество холестерина от 0,1 до 1,0 мг в 200 мг

KBr. Тщательно размельченной и рав, номерно перемещенной смесью наполняют прессформу, изготовленную известным способом, и прессуют таблет.ку под вакуумом 0,1-0,2 кПа и давлении 300 кгс/смг . Регистрируют

ИК-спектр в области 900-1200 см на спектрофотометре UR-20 при скорости сканирования 64 см/мин,щелевой программе 4. Для полосы 1 С-О

1065 см находят значение оптической плотности по методу базовой линии.

На табл.1. приведены результаты измерений оптической плотности.

Значения оптической плотности т С-О холестерина (табл. KBr) Концентрация, С, мг Оптическая плотность

0,1308

0,1451

0,1575

0,1684

0,1845

0,21 78

0,2255

0,2800

0,2947

0,3373

Пример 1. Количественное определение холестерина в сыворотке крови.

В пробирку со шлифом, объемом

25 мл, наливают 10,0 мл спиртовог раствора КОН (24 на 96 С НЕОН) и вводят по каплям 0,5 мл сыворотки

24573 4 крови. Пробирку закрывают пробкой, хорошо взбалтывают и ставят на водяную баню или в термостат на 1 ч (г = 37-40 C).

% После проведения гидролиза содержимое пробирки охлаждают и прибавляют 5,0 мл СС(4, хорошо взбалтывают.

Раствор переносят в делительную

1в воронку, нижний слой, т.е. экстракт

СС14, сливают в сухую пробирку.

На аналитических весах точно взвешивают 200,0 мг предварительно растертого спектрально чистого бромида

О калия и помещают в фарфоровую чашку.

Пипеткой отбирают 2,0-3,0 мл (точный объем) зкстракта СС14 и выливают íà KBr. Растворитель испаряют в сушильном шкафу на протяжение

20 10-15 мин при 70-80 С.

Полученный сухой остаток хорошо растирают в той же фарфоровой чашке, полностью переносят в прессформу и пресуют. Получают прозрачную пластинку, состоящую из KBr и холестерина.

Регистрируют ИК-спектр полученной пластинки (таблетки) на спектрометре UR-20 в области 950-1200 см при скорости сканирования 64 см/мин,ще30 левой программе 4, масштабе записи

100 см /см, с компенсационной таблеткой состоящей из КВг.

Интенсивность измеряемой полосы находят по методу "базовой" линии и вычисляют оптическую плотность по формуле где 1О и 1 - интенсивности поглоЩ щенного и пропущенного излучения.

Расчет концентрации холестерина в сыворотке крови с учетом разбавления проводят по формуле

43

D+ 0 017 V) 100 ()

0 259 Vã Vç, 1 где V t, V — объем СС14, взятый для экстракции (V ) и ана5О лиз е (V2);

Ъ вЂ” объем сыворотки крови.

Пример 2. Количественное определение холестерина в тканях печени, мышцах.

Для анализа берут 3,00 г печени или другого объекта,(точная навеска), из которых, зкстрагируют липиды по методу FoIk.

924573

Продолжение табл.3 чени, г общии холе

i стерин холестерин дигитония осажденный

0 3266 0 1463

0,3460

0,3130

0,1376

0,1433

0,1506

0,3230

Таблица 4

Взято сыровотки, мл

Найдено холестерина,мг/3

158,73

158,70

166,66

142,85

148,14

0,20

139 10

0,50

152,80

154,85

156,19

145,95

Найдено холестерина мг/г печени

Взято печени, r

0,1466

0,1416

0,3243

0,3126

3,0

Всю навеску липида растворяют в

3,0 мл СНС1, 0,01 мл этого раствора разделяют методом тонкослойной хроматографии (гексан, диэтиловый эфир, уксусная кислота 70 : 30 : 1) . S

Пятна дигитонилсодержащего И общего холестерина вырезают и вымывают из них холестерин 3,0 мл СНС(На аналитических весах точно взвешивают 200,0 мг предварительно 10 растертого спектрально чистого бромида калия и помещают в фарфоровую чашку.

Полученный раствор холестерина (3,0 мл) выливают на бромид калия.

Растворитель испаряют в сушильном шкафу на протяжение 10-15 мин при

70-80 C.

Полученный сухой остаток хорошо растирают в той же фарфоровой чашке,полностью переносят в пресс-форму и прессуют. в

Полученную прозрачную пластинку, состоящую из KBr и холестерина, анализируют, как описано в примере 1, Расчет концентрации холестерина проводят по формуле (1).

В табл. 2-4 представлены результаты количественного определения холестерина в крови, тканях, сыворотке крови соответственно.

Т а б л и ц а 2

Результаты количественного определения холестерина в крови (ИК-спектроскопия) Введено сыворот- Найдено холестеки, мл рина, мг/4

Таблица 3

Результаты количественного определения холестерина в тканях (ИК-спектроскопия) общий холе- холестерин стерин дигитония осажденный

Найдено холестерина

Взято пе- мг/г печени

Результаты количественного определения холестерина в сыворотке крови (фотокалоримет- рия) Предлагаемый способ (по сравнению с клиническими методами анализа) дает возможность с большей точностью определить холестерин в биологических объектах.

Применение кристаллических образцов (аластинка KBr) создает удобство в работе и повышает чувствительность метода,.что позволяет использовать для анализа меньшее количество биоматериала. формула изобретения

Способ определения холестерина в биологических тканях путем обработки пробы реагентами с последующим измерением светопоглощения полученной реакционной смеси, о т л и7 924573 8 ч а ю шийся тем, что, с целью поглощения в области 1065 см:опреповышения чувствительности способа, деляют концентрацию холестерина. из пробы экстрагируют липиды, экст- Источники информации, ракт подвергают исследованию методом принятые во внимание при экспертизе инфракрасной спектроскопии в облас- % 1. Патент США 11 . 3884638, ти 950-1200 см и по интенсивности кл. 6 01 N 33/ 16, 1975.

Составитель С. Малютина.

Редактор C. Юско Техред T.Маточка Корректор М. Пожо

Заказ 2806/60 Тираж 883 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал Illlll "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная,4