Способ определения аденозинтрифосфорной кислоты в крови

 

Союз Советскив

Социалнстмчесиии

Республик

О П И С А Н И Е < 905787

ИЗОБРЕТЕНИЯ

И ЛВтОВСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСтВЮ (б} j Дополнительное к эвт. свид-ау(22)Заявлеио31.07.78 (21} 2662644/28-13 с ярисоеаяиеиием заявя» М(23 т ПрноритетОиублниоваио15.02. 82. бюллетень М 6

Дата ояублняоваияя описания 15.02.82 (53)M. Кл.

G 01 и 33)48

9вударствсавЫ1 ewnet

Иьр ав лвлаи взабретеввв я открыта» (53) УДK 612. 13 (088.8) (72) Авторы . изобретения

П.N. Яверб аум и Л.И. Издебская о

Иркутский. государственный медицинский институт (7l ) Заявитель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АДЕНОЗИНТРИФОСФОРНОЙ

КИСЛОТЫ В КРОВИ к(ек- 0 У где СК—

Е к

Е— о

Изобретение относится к технике определения аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ} в крови и може быть использовано в биохимических анализах в научно-исследовательских и клинических лабораториях, преимущественно при изучении отдельных звеньев адениловой системы.

Наиболее близким решением к изоб10 ретению является способ определения АТФ в крови путем приготовления беэбелкового центрифугата пробы с последующим добавлением в реакционную смесь гексокиназы. Точ15 ность известного способа 10-15Х (13 .

Недостатком известного способа является его сложность, так как методика определения АТФ основана на многостадийности приемов и на многократном измерении оптических плотностей. Кроме того, для определения

АТФ требуются дорогостоящие реактивы и оборудование.

Цель изобретения — упрощение снособа.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения АТФ в крови путем приготово ления безбелкового центрифугата пробы с последующим добавлением в реакционную смесь гексокиназы, в реакционной смеси определяют глюкозу ,глюкозооксидазным методом после добавления гексокиназы и без ее добавления,-полученные образцы колориыетрируют со стандартным раствором глюкозы, а АТФ определяют по формуле концентрация АТФ, мг.Х; коэффициент пересчета АТФ; эКстинкция контрольной пробы экстинкция пробы лосле добавления гексокиназы;

90578

Š— экстинкция стандартного раСт створа.

Способ осуществляют следующим образом.

Количественное определение АТФ проводится по уменьшению содержания глюкозы в эритроцитах, происходящее вследствие реакции глюкоза + АТФ вЂ”

-1 глюкозо-6-фосфат + АТФ. Процесс катализируется ферментом гексокиназой.

Концентрацию АТФ вычисляют по формуле

Аналогичную процедуру проводят с контрольной пробой, где вместо раствора гексокиназы берут 0,05 мл

ТЭА-буфера.

Контрольную и опытную пробу ста" вят в термостат на 20-30 мин при

Ю

37 С. Затем в пробах определяют со А о) Ъ 15

СТ где С вЂ” количество АТФ, мг, К вЂ” коэффициент пересчета АТФ!

Š— экстинкция контрольной пробы, к

Š— экстинкция пробы после добав-

0 ления гексокиназы; !

»; экстинкция стандартного раствора

Количество глюкозы определяют глюкозооксидазным методом. 25

Определение содержания АТФ в эритроцитах проводится следующим образом, Взятую кровь переносят в охлажденную до 2-4ос пробирку, содержа- 16 щую 3-4 капли раствора гепарина. Центрифугируют при +2 C !О мин при

2500-3000 об/мин. Плазма отсасываетая и выбрасывается. Пробирки помещаются в ледяную баню. К уплотненно" му осадку эритроцитов в пробирке добавляется двукратный объект 15Ж-ного раствора трихлоруксусной кислоты (ТКУ). Через f0 мин вторично центрифугируют fO мин при 3000 об/мин.4О

Последующие этапы анализа проводят с надосадочной жидкостью. В опытную пробу берут 4 мл 0,05 И раствора триэтаноламинового(ТЭА) буфера (рН ?,5-7,6), 0,35 мл 0,1 М раствора HgCIg, 0,4 мл беэбелкового центрифугата. Содержимое пробирок доводят, до рН 7,4 1-2-мя каплями

5 М раствора К СО . Затем добавля-, ют 0,05 мл I 0-1,5 -ного раствора гексокиназы.

7 4 держание глюкозы. Для этого в две пробирки (контроль и опыт) берут

4,5 мл дистиллированной воды, добавляют по 3 мл дианизидинового реактива (к 50 мл 0,4 М калий-фосфатного буфера при рН 5,9 приливают I мл

l -ного спиртового раствора О-дианизидина и доводят водой до IOO мп, реактив готовится в день анализа), В контрольную и опытную пробирку приливают по 0,3 мл раствора из соответствующих пробирок предыдущего этапа анализа, добавляют по 0,1 мл свежеприготовленного О,l -ного раствора глюкозооксидазы, 0,1 мл свежеприготовленного 0,1Х-ного раствора пероксидазы или 0,5 -ного раствора гемоглобина и инкубируют 30 мин при

45ОС. После инкубации в пробирки добавляют по 2 мл 50 -ного раствора серной кислоты. Одновременно готовят стандартный раствор 4,7 мл дистиллированной воды, 3 мл дианизи- динового реактива, 0,03 мл 100 мг -ного раствора глюкозы, 0,1 мл О,l -ного раствора глюкозооксидазы,O, 1 мл

О, l -ного раствора пероксидазы инкубируют 30 мин при 45 С. После инкубации добавляется 2 мл 50 -ного раствора серной кислоты.

После охлаждения содержимого пробирок до комнатной температуры измеряется экстинкция растворов на фотоэлектроколориметре в кювете с расстоянием между рабочими гранями !О мм, Измерение оптической плотности ведется против компенсационной жидкости, содержащей 5 мл воды, 3 мл дианизидинового реактива и 2 мл 501-ного раствора серной кислоты, при .зеленом светофильтре.

Расчет содержания проводят по приведенной формуле, при этом минимальное содержание АТФ по предлагаемому способу равно 15 и точность определения

АТФ 12-14 .

По предлагаемому способу проведено 65 исследований содержания АТФ в эритроцитах крыс. Исследование проводилось с 13 здоровыми животными (контрольная группа) и с 52 крысами, отравленными свинцом.

В контрольной группе получено следующее содержание АТФ в эритроцитах, мг/.: 37,5; 44,5; 48,7; 50,5;

IOf 4; lll 5; 114,1.

Среднее содержание АТФ 72,7 мг Х.

5 905787 6

Средняя ошибка среднего арифмети- за счет различного уровня обмена в ческого +7,4 мг X. эритроцитах на момент декатизацни

Среднеквадратическое отклонение крыс.

+26, 5 мг X. Результаты определения содержания коэффициент вариации 36,5X. s АТФ в эритроцитах у крыс, отравленОтмеченную вариабельность следу- ных свинцом, в различные периоды ет отнести за счет индивидуальных после окончания затравки приведены особенностей животного, в частности в таблице, 13

13

115,5

67,7

103,6

88,9

5,9 7,5

6,3

9,8

36,6

22,6

23,2

21,3

П р и м е ч а н и е. n — число наблюдений;

И вЂ” среднее арифметическое; m — средняя ошибка среднего арифметического; r — среднеквадратическое отклонение. гексокиназа

Таким образом, концентрация АТФ зная реакция: глюкоза + АТФ в эритроцитах крыс контрольной групИд ++ глюкозо-6-фосфат + АТФ, в результапы составляет 77 мг X. В последние те которой расходуется глюкоза, сосроки развития свинцовой интоксикадержащаяся в эритроцитах. В контроль-, ции уровень АТФ в эритроцитах белых ной пробирке уровень глюкозы не измекрыс повышается. няется, так как в реагирующей систеПример ° Свежевзятую кровь ме отсутствует гексокиназа. лабораторного животного (крысы) 35

4-8 мл помещают в охлалденнУю до Используемый ТЗА-буфер (0,05 м, 2 С и смоченнУю гепаРином пРобиРкУ. РН 7 5-7 6) готовят следующим обраДлЯ выделениЯ эритроцитов пРобУ кро- зом. 4,65 г гидрохлорида триэтанолви центрифугируют 10 мин при амина растворяют в 200 мл дистилли2500 об/мин. ОтделившУюсЯ в РезУль- о рованной воды и добавляют 11 мл 1н. тате центрифугированиЯ плазмУ отса- раствора ЯаОН, затем полученный растсывают. ДлЯ осажДениЯ белков эритро- вор доводят дистиллированной водой циты смешивают с предварительно охПосле термостатирования опреде- " соотношении 1:1 (1,5 мл эритроцитов .4s ляют содержание глюкозы в контрольи 1,5 мл ТХУ), и пробирку помещают ной и опытной пробирках глюкозооксина 10 мин в ледяную баню, после чего азным спос б м я дазным способом. Для этого из контвтоРично Центрифугируют 0 Н при рольной и опытной п б к б рольно и опытной пробирок берут

2500 об/мин. Полученный безбелковый по 0 3 „ ж мл содержащегося в них растЦентрифугат собиРают в чистУю про- 50 во а и п „,, вора и приливают в пробирки, в которые предварительно внесено по

Для проведения гексокиназной ре- 415 мл дистиллированной воды и акции в две пробирки (контроль и 3 0 мл.дианизидинового реактива. 3а опыт) приливают реактивы. Затем тем проверяют РН и при необходимости обе пробирки помещают в термостат

55 доводят до 5,9, и приливают в обе при 37 C на 20 мин B результате до пРобиРки по 0,1 мл 0,1%-ного Растбавления раствора гексокиназы в опыт- воРа глюкдзооксидазы и 0,1%-ного иой пробирке протекает гексокина- раствора пероксидазы. Одновременно

905787 готовят стандартный раствор, содержащий 4,7 мл дистиллированной воды, 0,03 мл стандартного раствора глюкозы (100 мг %), 3 мл дианизидинового реактива, О,1 мл 0,1%-ного раствора глюкозооксидаэы и О,i мл

0,1%-ного раствора пероксидазы.

Используемый при этом дианизидиновый реактив готовят в день проведения анализа. 50 мл 0,4 М калий— фосфатного буфера при рН 5,9 приливают 1 мл IX-ного спиртового раствора О-днанизидина и доводят дистиллированной водой до 100 мл.

Все три пробирки (контроль, опыт, стандарт) помещают в термостат при

45 С на 30 мин. В этих условиях

0 протекают следующие реакции: глюкозооксидаза глюкоза + 0 глюконолактои + Н Оу

- — Ъ пероксидаз

Я окисленный дианизидин + Н О.

Окисленная форма дианизидина имеет выраженную окраску.

В

Через 30 мин термостатирования все пробирки извлекают и в каждую приливают по 2 мл 50%-ной серной кислоты. В результате добавления серной кислоты образовавшаяся оранжево-желтая окраска переходят в розовую»

После охлаждения пробирок с содержы4ым до комнатной температуры (21-23 C) растворы колориметрируют на фотозлектроколориметре при зеленом светофильтре (длина волны 530 нм) в кюветах с расстоянием между рабочими гранями 10 мм против раствора, содержащего 6 мп дистиллированной воды, 3 мл дианиэицинового реактива и 2 мл 50%-ной серной кислоты

Используя значение коэффицйента пересчета АТФ мг Х 676,0 и измеренных величин экстинкций К1(экстинк ция контрольной пробы) 0,028, ЕО (экстинкщ4я опытной пробы) 0,016 и

Е (зкстинкция стандартного раст8 воРа) 0,10, вычисляют концентрацию

АТФ по формуле

"(к "О ) 676,0х(О,ОЯ- 0046 )

=ЩЯX1 QДТФ

Точность количественного определения АТФ по предлагаемому способу соответствует точности известного способа.

Предлагаемый способ проще известного и исключает многоэтапный анализ при количественном определении

АТФ в эритроцитах.

Кроме того, при использовании предлагаемого способа снижается стоимость одного анализа за счет исключения дорогостоящего оборудования и реактивов более чем в 1000 раз. и Формула изобретения

Способ определения аденозиитри" фосфорной кислоты (АТФ ) в крови путем приготовления безбелкового центрифугата пробы с последующим добавлением в реакционную смесь гексокиназы, о т л и ч а ю щ и й— с я тем, что, с целью упрощения способа, в реакционной смеси определяют глюкозу глюкозооксидазиым методом после добавления гексокина". зы и без ее добавления, полученные образцы колориметрируют со стандартным раствором глюкозы, а АТФ,: определяют по формуле

КЯ -Fo)

) где С вЂ” концентрация АТФ

К - коэффициент пересчета АТФ,мг%;

Š— экстиикция контрольной пробы

Е - зкстинкция пробы после добавления гексокиназы", Š— экстиикция стандартного раствора.

4S

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1, Асатиани В.С. Ферментные методы анализа. М., "Наука", 1969, с. 262-266.

Составитель А.Бражникова

Редактор Л.Плисак Техред М. Надь Корректор А.Дзятко

Заказ 357/63 .Тираж 882 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал 1ПЙ Патент, r. Ужгород, ул. Проектная, 4