Способ получения вируса гепатитаа

О П И С А Н И Е <»>8I08II

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советских

Социалистических

Республик

Н ЬЕтОЕСКОМЬ СВИДЕтЕЛЬСтВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 19.02.79 (21 j 2727083/28-13 с присоединением заявки №вЂ” (23) Приоритет— (51) М Кл з

С 12 К 7/00

Государственный комитет

СССР не делан изобретений и открытий (43) Опубликовано 07.03.81. Бюллетень № 9 (53) УДК 576.858 (088.8) (45) Дата опубликования описания 07.03.8.1 (72) Авторы изобретения

М. С. Балаян, А. Г. Анджапаридзе и Е. А. Толь кая

Институт полиомиелита и вирусных энцефали в .",.

АМН СССР с (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВИРУСА ГЕПАТИТА А

Изобретение относится к медицинской вирусологии.

Известен способ получения вируса гепатита А путем экстракции фекалий больных гепатитом А (1).

Однако известный способ не позволяет получить вирус в количестве, достаточном для приготовления вакцин, и используется только для диагностики заболевании, при этом частота обнаружения вируса гепатита А в фекалиях больных составляет

8 — 15%.

Целью изобретения является повышение выхода вируса.

Эта цель достигается тем, что полученным фекальным экстрактом заражают предварительно обработанные трипсином в концентрации 15 — 60 мкг/мл культу„-ы клеток перевиваемых клеточных линий Не1а и

ПЭО, культивируют в среде с тем жс содержанием трипсина, а затем пассцруют в той же среде с дополнительным введением фекального экстракта, не содержащего вирус гепатита А, в конечной концентрации

33 — 50%

Способ осуществляют следующим образом.

Приготавливают фекальный экстракт, для этого берут 5 г фекалий больного, содержащих вирус гепатита А, добавляют

20,0 мл 0,1 М раствора фосфатно-солевото буфера (ФСБ), вносят несколько стеклянных бус, и смесь встряхивают в течение

15 мин на шуттсль-аппарате, после чего ее

5 заморажпвают — оттаивают трехкратно при — 70 С/+ 37 С. Затем смесь центрифугируют в течение 30 мин при 3000 об/мин, надосадочную жидкость отделяют и оставляют при 4 С. К осадку добавляют !0,0 мл

10 0,1 М раствора ФСБ и процедуру обработки повторяют еще один раз. Полученную надосадочную жидкость собирают и сливают с первой надосадочной жидкостью.

Объединснньш материал вновь центрифугируют в течение 30 мин при 10000 об/мин и собирают надосадочную жидкость. После этого производят обработку фреоном113: добавляют 2 объема фреона-113 на

1 объем жидкости, встряхивают в течение

1 ч на шуттель-аппарате, центрифугируют в течение 30 мин при 3 000 об/мин, собирают надосадочную жидкость и измеряют ее объем. Далее вируссодержащпй материал концентрируют путем осаждения полиэти2б лснгликолсм (ПЭГ) с молекулярным весом

6000, для чего берут 1/10 весовую часть сухого ПЭГ (по отношению к весу жидкости), растворяют его полностью в данной жидкости и оставляют на ночь при

4 С. Утром раствор центрифугируют в те810811

55

3 чспие 30 мин при 10000 об/мин и осадок рссуспендируют в дистиллированной воде, содержащей антибиотик канамицип в Ko|I. цснтрацпп 0,5- — 1,0 мг/мл. Объем дистиллированной воды составляет 1/5 от объема

IIcxo, IIIoÉ BHj?) ссодср?кащей ?ки Гкости. l 1олучсппь|й в результате такой процедуры материал используют для заражения клеток. Параллельно готовят очищенный и концентрированный экстракт из фекалий, не содержащих вирус гепатита А.

Культуры клеток Hela и ПЭО выращивают в среде Игла без сыворотки в пробирках (1,5Х15 см). Заражение культур производят через 18- — 24 ч после псресева клеток: удаляют культуральную жидкость и добавляют концентрированный и очищен ный фекальный экстракт, содержащий вирус гепатита А, из расчета 0,1 мл экстракта на 250000 — 500000 клеток. После контакта в течение 1 ч при 37*С в ка?кду1о пробирку с культурой вносят по 1,0 — 2,0 мл среды Игла, содержащей трппсин в концентрации 15 — 60 мкг/мл. Пробирочные культуры инкубируют в течение 18 — 48 ч при 37 С. Последующие пассажи также проводят в пробирочных культурах со средой Игла, содержащей трипсин в re?; жс концентрациях, но с добавлением экстракта «нормальных» (не содержащих вирус гепатита А) фекалий в конечной концентрации 3,3 — 5,0%.

Для обнаружения вируса гепатита А используют метод иммуноэлектронной микроскопии (ИЭМ) . Стандартную сыворотку, в которой было установлено наличие антител к вирусу гепатита А, разводят физиологическим раствором 1:40 — 1:1000 (в зависимости от ее титра) . После этого

0,2 мл разведенной сыворотки смешиваюг с 0,8 мл вируссодержащей жидкости (фекальный экстракт, культуральпая жидкость, гомогенат клеток и т. п.). Смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч и затем ночь при 4 С. Утро I смесь цснтрифугируют в тсчение 2 ч при

15 OGO об/мин, осадок ресуспендируют в

HccKo II I lIx каплях дистиллированной воды и смешивают с равным объемом 2 iII раствора фосфорно-вольфрамовой кислоты (рН

6,8), взятой в качестве контрастирующего вещества. Чс1?сз 30 с смесь наносят на

c!lcIIII3;l,HhIc сетон«п д IH электронной микроскопии. Объекты просматривают в электронном микроскопе при увслпчспии

50 000- -100 000.

При просмотре в электронном микроскопе препаратов культуральной ж1дкостп и гомогепата клеток нз зара?кеппых вируссодержащим материалом культур Icla

ПЭО обнаруживают скопления характерных частиц вируса гепатита Л диаметром

27 пм, покрытых венчиком антител.

При просмотре аналогичных препаратов из незараженных культур пли культур, в

10 !

I5

5 5 которые вносили материал, нс содержащий вирус гспатита А, скопления вирусных частиц не наблюдагот.

Уровснь продукции вируса гепатита Л в культурах клеток ориентировочно оценивают путем сопоставления количества образовавшихся частиц этого вируса с количеством частиц полиовируса 1 типа (штамм Махони), выращенного в идентичных условиях, Например: сели в 1,0 мл

?кидкости содержится 5 10 инфскционных (бляшкообразующих) единиц вируса Махони, то это количество соответствует

5 10 вирусных частиц, обнару?киваемых электронномикроскопически, оно же соответствует 6000 — 8000 частиц, аггрсгированных антителами и выявляемых методом

ИЭМ в пяти ячейках сетки. При исходной концентрации вируса Махони 5 10, 5 10 и т. д. инфекционных единиц в

1,0 мл оно составляет соответственно

5 . 10, 5 10, 5 10 и т. д. Физических вирусных частиц и 4 000 †000, 2 000—

3 000, 1000 †20 аггрегированных антителами вирусных частиц в пяти ячейках сетки при иммуноэлектронной микроскопии.

Обратный пересчет позволяет на основании известного количества вирусных частиц, определяемых методом ИЭМ, ориентировочно судить о концентрации вирусных частиц в исходном препарате.

Для такой оценки продукции вируса гепатита А в клеточных культурах этот ви рус, также как полиовирус 1 типа Махони, выращивают в культурах Неlа. Далее определяют количество образовавшихся вирусных частиц, выявляемых методом ИЭМ в ячейках сетки. Вирус Махони до исследования в ИЭМ титруют в культуре ткани и определяют количество физических частиц, соответствующих каждому данному разведению 10, 10-, 10, 10 . После этого каждое разведение исследуют на содержание вирусных частиц методом ИЭМ. Сопоставляют результаты ИЭМ, полученные с вирусом гепатита А и с вирусом Махопи, после чего выбирают то разведение вируса Махони, в котором количество частиц этого вируса наиболсс близко к количеству частиц вируса гепатита А.

При выращивании вируса гепатита А в клеточных культурах содcl??KBIIHc частиц этого вируса в культуральных жидкостях чсрсз 12 — 20 ч после заражения, установленное с помощью описанного выше способа, составляет от 1 10 до 5- 10 вирусных частиц в 1,0 мл. Предлагаемый способ позволяет поные IT!. выход вируса.

Форму",a изобрстсппя

Способ получения вируса гепатита А путем экстракпии фск"..ëè! I больных гепатитом А, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода вируса, получен5 ным фекальным экстрактом заражают предварительно обработанные трипсином в концентрации 15 — 60 мкг/мл культуры клеток перевиваемых клеточных линий Не1а и ПЭО, культивируют в среде с тем же содержанием трипсина, а затем пассируют в той же средс с дополнительным введением фекального экстракта, с содержаше

810811

6 го вирус гепатита А, в конечной концентрации 3 3 5 0%

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

5 1. S. М. Teinstone and at al. «Defection

hy imn1une electron microscopy of a virus—

like antigen associated with acute illness», Science, чо1. 182, р. 1026 — 1028, 1!173.

Корректор О. Тюрина

Изд. № 234 Тираж 530

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Загорская типография Упрполиграфиздата Мособлисполкома

Редактор Г. Петрова

Заказ 2146

Составитель С. Малютина

Техред А. Камышникова