Фагкмi для идентификации r-плазмид

Саав Советских

О П И С А Н И Е «1786330

ИЗОВРЕТЕН ИЯ

K АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Социалистических республик Ф 4 ф (61) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 30.07.79 (21) 2806888/28-13 (51) М.Кл. С 12 N 7/00 с присоединением заявки— (23) Приоритет— (43) Опубликовано 30.04.82. Бюллетень ¹ 16 (45) Дата опубликования описания 07.05.8?

Гасударственный комитет

СС С.P

ы делам изобретений и отнрытий (53) УДК Л576.8.095..382 (088.8) з

А. И. Коротяев, М. Ш. Манувахова, В. Н. Рейнгольд,".

Н. М. Шестопалова и И. В. Домарадский

Кубанский государственный медицинский институт им. Красной Армии (72) Авторы изобретения (71) Заявитель (54) ФАГ КМ1 ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ Я-ПЛАЗМИД

Изобретение относится к области медицинской микробиологии и может быть использовано для идентификации вновь выделенных R-плазмид.

Известен донорспецифический фаг PR5 для идентификации R-плазмид (1).

Однако известный фаг PR5 не позволяет идентифицировать R-плазмиды I,К, I Ä,Х групп несовместимости.

Целью изобретения является новый фаг, обладающий донорспецифическими свойствами в отношении бактерий, несущих R-плазмиды I„,К, I„,Х, групп несовместимости.

Донорспецифический фаг КМ1 для идентификации R-плазмид I„,Ê, I,Х групп несовместимости хранится в коллекции Тбилисского НИИ вакцин и сывороток под номеоом Ф-92.

Морфологические признаки.

Фаг KMI состоит из головки и отростка, заканчивающегося базальной пластиной, от которой отходят тонкие нити. Головка имеет форму октаэдра с осями симметрии

4: 3: 2. Средняя длина ребра головки

121 -8 нм. Отросток фага прямой, длина его 127,2+-6,3 нм, ширина 19,1 =1,7 нм, ширина базальной пластинки 41,9 12 нм.

Чехол отростка покрывает не весь стержень, оставляя часть его у головки открытой (14,8 нм). Чехол отростка способен к сокращению. При этом виден стержень шириной 8 нм. Длина сокращенного чехла отростка 56,6 нм, ширина 23,3 нм. Фаг

S адсорбируется на поверхности клеток, несущих плаз миду лекарственной устойчивости рКМЯ 77 и образующих донорные ворсинки.

Фаг KMI не размножается в культуре

F. со11М без плазмнд, но приобретает такую способность при введении в этот штамм плазмиды pKMR 77, выделенной от больного дизентерией в Краснодарском крае.

Кроме того, фаг лизирует клетки штамма

Е coli М с плазмидами групп несовместимости 1,,К, 1„,Х. При титровании фага в культуре Е coli М с плазмидами pKMR 77, Р6К (представитель группы I,Х) негативные колонии прозрачные, около 1 мм в диа20 метре. При размножении на Е coli М с плазмидой R16 негативные колонки сохраняют размеры, но становятся мутными.

Фаг KMI лизирует все штаммы Е. coli

К12, независимо от наличия или отсутствия в них плазмид.

Пример ы. С целью выделения донорспецифического фага используют плазмиду pKMR 77. Плазмида обнаружена у штамма Shigella flexneri 2а, выделенного от больного дизентерией, и контролирова786330

Формула изобретения

Техред И. Заболотнова

Корректор И Осиновская

Редактор П. Горькова

Заказ 362/271 Изд. М 123 Тираж 505 Подписное

НПО «Поиск» Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, К-35, Раушская наб., д. 4/5

Тип. Харьк. фил. пред. «Патент»

3 на устойчивостью к пенициллину, хлорамфениколу, стрептомицину, тетрациклину.

pKMR 77 методом коныогации была передана в штамм Е. coli М, обладающий хромосомной устойчивостью к рифампицину. Частота передачи плазмиды 1 10-, Е. co!i М с плазмидой pKMR77 нелизируется стандартными донорспецифическими фагами Qp, fl, f2, PR4, РКМЯ77, тормозит размножение фага Л в 30 раз, не подавляет размножение фага ТЗ, pKMR 77 не угнетает F — опосредованную конъюгацию, т. е. является fin. Проверка совместимости плазмиды с представителями групп I„,Р1—

FV u Inc P показывает, что она не относится ни к одной из этих групп. Источником выделения фата служат сточные воды, которые предварительно центрифугируют при

6000 об/мин с целью избавления от посторонней микрофлоры. Затем применяют метод обогащения, состоящий в смешивании

1 мл сточных вод, 1 мл ночной бульонной культуры Shigella flexneri 2а с пл азмидой

pKMR 77 и 9 мл фагов6го бульона. Смесь инкубируют в течение ночи при 37 С, затем обрабатывают хлороформом (1: 10

30 мин п ри постоянном перемешивании), центрифугируют при 6000 об/мин для осаждения убитых бактерий взвешенных частиц и повторно обрабатывают хлороформом в течение 10 мин.

Присутствие фага в центрифугате опре,деляют титрованием по методу Gratia.

С этой целью делают ряд разведений фага 1: 10, затем к 1 мл каждого разведения добавляют 0,2мл культуры Е. coli Мв.стационарной фазе роста, инфицированной соответствующими плазмидами и без них (контроль), Так исследованы 12 проб сточных вод. Из колоний фага, выросших в культуре Е. coli М с плазмидой pKMR 77, фаг отвивают и подвергают дальнейшему излучению.

Методом титрования со Gratia и с помощью спот-теста устанавливают, что выделенный фаг не способен размножаться в культуре Е. Coli М, не содержащей плазмид, но приобретает такую способность при введении в этот штамм плазмиды pKMR 77, что свидетельствует о наличии у него донорспецифических свойств в отношении этой плазмиды.

Фаг обозначен КМ1. Рабочий титр

1. 10в — 1 10 частиц в 1 мл. Фаг не инактивируется хлороформом.

Использование фага позволяет быстро определять принадлежность вновь выяв20 ленных R-плазмид к группам несовместимости I,К, I,Õ, что ранее не представлялось возможным, так как фаги, донорспецифические в отношении штаммов с плазмидами этих групп, не были выделены.

Фаг КМ1 для идентификации R-плазмид (хранится в коллекции Тбилисского

30 НИИ вакцин и сывороток под номером

Ф-92) .

Источник информации, принятый во внимание при экспертизе:

35 1. Wong F. Н., Bryan L. Е. «Characteristics of PR 5, à lipid-containing plasmid-dependent phage, Can. J. Microbiology 1978, V. 24, М 7, р. 875 — 882.