Способ дифференциации вирулентных и вакцинных штаммов вируса гриппа

 

СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ВИРУЛЕНТНЫХ :и ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ. ВИРУСА ГРИППА путем заражения вирусом гриппа клеток с последующим инкубированием и гистологическим исследованием зараженных клеток, о т л и ч а ю 1Д и и с я тем, что,с целью ускоре-. НИН способа, для заражения используют лейкоциты периферической,крови человёка, вирус вносят из расчета 1000 ЕИДдо на клетку и гистологические исследования проводят через 5, 15, 30 мин до 48 ч инкубирования.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

„„SU„„778263

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 2755048/28-13 (22) 16.03. 79 (46) 15.01,84, Бюл. Р 2 (72) А,Г. Стопчанская, В.И. Новицкий и С.H. Мокиенко (71) Одесский научно-исследовательский институт вирусологии и эпидеми- ологии им, И.И. Мечникова (53) 576.8.093.23(088.8) (56) 1. Жилова Г.П. Сб. Проблемы гриппа и вирусных ОР3 Л., 1973, с. 54-64.

3(59 С 12 N 7/00//С 12 Q 1/70 (54) (57) СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ВИРУЛЕНТНЫХ И ВАКЦИНННХ ИТАММОВ ВИРУСА

ГРИППА путем заражения вирусом гриппа клеток с последующим инкубированием и гистологическим исследованием зараженнйх клеток, о т л и ч а— ю шийся тем, что, с целью ускоре-. ния способа, для заражения используют лейкоциты периферической крови человека, вирус вносят из расчета 1000 ЕИД в на клетку и гистологические исследования проводят через

5, 15, 30 мин до 48 ч инкубирования.

778263

- Изобретение относится к областй

-медицины, а именно к определению в«ир«улентности вируса гриппа.

Известен способ дифференциации вирулентных и вакцинных штаммов ви-

-руса гриппа путем заражения вирусом 5

-гриппа клеток с последующим инкубированием и гистологическим исследованием зараженных клеток fl).

Однако при известном способе зараженные вирусом гриппа клетки в 10 среднем культивируют в течение 7 дней для получения необходимого ответа.

Целью йзобретения является ускор ение способ а.

Эта цель достигается тем, что )5 для заражения используют лейкоциты периферйческой крови -человека, вирус вносят из расчета 1000 БИП б на клетку" и гистологические исследования проводят через 5, 15, 30 мин до 48 ч инкубирования.

В исследованиях исцользуют штаммы вируса гриппа А(Н И2) - выделенные от больных гриппом в пе«рйод эпи демии в 1976-1977 г.г. (2-3 йасаж на куриных эмбрионах) и вакцинный вирус A (виктория 35)72,- йсйользуемый для приготовления живой гриппозно и вакци ны. для накопления вируссодержащей аллантоисной жидкости испытуемым штаммом вируса заражают 10-ll-дневные куриные эмбрионы, которые вскрывают через 48-72 ч. Сорбцией - элюцией на куриных эритроцитах получают очищенную и концентрированную 35 "-взвесь вируса. Элюцию осуществляют либо в 0,11 М фосфатном буфере, ли6о среде 199. К элюату добавляют человеческий альбумйн до конечной концентрации 1Ъ. . 40

Титрованием на ЕО-11-дневных куриных эмбрионах определяют инфекционный титр элюата. В период проверки инфекционного титр@ элюат хранят при 4 С

Ле«йко«цйты периферической крови """человека "йейоаредств«енно йосле=выде-" ления заражают 1000 ЕИД на клетку, испытуемого вируса. Через 5 мин после, добавления вируса одну треть взвеси клеток после тщательного перемеши вания центрифугируют 8-10 мин при

1000 об/мин, осадок кЛеток фиксируют и заливают в эпоновые смолы.

Оставшуюся взвесь лейкоцитов продолжают культивировать в течение

1 ч при 36 С, затем центрифугируют

8-10 мин при -1000 об/мин, надосадок удаляют, а к осадку добавляют среду

199 с 1%-ным альбумином человека (концентрация клеток в культивируемой смеси 1 2х10 /мл) и помещают в термостат при 36 С. Половину взвеси клеток после тщательного пипетирования фиксируют и заливают в эпоновые смолы через 7 ч, а оставшуюся - через 24 ч., Готовят ультратонкие срезы и изучают их в электронном микроскопе. На ультратонкиХ срезах клеток, зафиксированных через 5 мин после заражения, определяют большое количество внутри- и внеклеточного вируса, независимо от вирулентности испытуемого штамма. В этот срок исследования различия между вйрулентным и вакцинным штаммом выражаются в более активной адсорбции вирионов вакцйнного штамма на эритроцитах, которые в небольшом количестве присутствуют во взвеси лейкоцитов.

Четкие различия между вирулентным и вакцинным штаммами выявляются при изучении ультратонких срезов лейкоцитов, зафиксированных через

7 ч после заражения. Вирионы вирулентнбго штамма не разрушаются нейтрофилами; внутри- и внеклеточно обнаружйвают многочисленные малоизмененные вирусные частйцы..

В противоположность этому количество внутри« и внеклеточных вирионов вакцинного штамма спустя 7 ч резко уменьшается и лишь в единичных нейтрофилах выявляют 2-3 интактные вирусные частицы.

Через 24 ч внеклеточно выявляют большое число вирионов лишь при заражении клеток вирулентными штаммами вируса гриппа вирионы вакцинного штамма в"этот период, как правило, не обнаруживаются.

Предлагаемый способ позволяет. отчетливо дифференцировать вирулентный и вакцинный штамм вируса гриппа через 24 ч (вместо 7 дней известным способом), Редактор И. Коляда и

Заказ 1030/1

Техред Ж.Кастелевич Корректор,O. Тигор

«В « е. 1

Тираж 522 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

По делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

IW I « I ë «

Филиал ППП, Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4