Способ отщепления сульфенильных групп от - сульфениламинокислот и сульфенилпептидов

 

t74CFCe "w MF 4 е

О П И С А-"Н И Е

ИЗОБРЕТЕНИЯ лв767090

Союз Советских.

Социалистических

Республик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. сеид-ву— (22) Заявлено 03.05. 78 (21} 2609922/23-04 (51)М. Кл 3 с присоединением заявки Мо»вЂ”

Государственный комитет

СССР по делам изобретений и открытий

С 07 С 103/52 (23) Приоритет—

Опубликовано 300980. Бюллетень Мо 36

Дата опубликования описания 30.0980 (53) УДК 547. 964. 4..07(088.8) (72) Авторы изобретения

P.Ý.Âåãíåð, Л.К.Полевая и Г.И.Чипенс

Ордена Трудового Красного Знамени институт органического синтеза AH Латвийской ССР (71) Заявитель (54) СПОСОБ ОТЩЕПЛЕНИЯ СУЛЬФЕНИЛЬННХ

ГРУПП ОТ И-СУЛЬФЕНИЛАМИНОКИСЛОТ

И N — СУЛЬФЕНИЛПЕПТИДОВ!

Изобретение относится к улучшенному способу отщепления сульфениль- ных защитнйх групп у й-сульфениламинокислот и н-сульфенилпептидьв и может найти применение в синтезе пеп - 5 тидов.

В качестве сульфенильйых групп в пептидной химии используют о-нитрофенилсульфенильную (Нфс), 2,4-динитрофенилсульфенильную и пентахлор- 10 сульфенильйую группы . (13, но наибольшее распространение имеет Нфс-. защитйая группа.

При отщеплении Нфс-груПпы киалотами (или другими соединениями, обладающими кислым характером) у пептидов, содержащих остатки S-ациламино- метилцистеина, S-тритилцистеина, триптофана и тирозина, наблюдаются яобочные реакции, связаннйе с взаимо-20 действием этих остатков с обраэующимся катионом о-нитроФенилсульфенй-: лия. Например, при ртщеплении Мсгруппы у N-Нфс-S-ацетамннометилцис теина хлористым водородом вместо ожи-25 даемого S-ацетаминометилцистеина получается S-Нфс-цистеин 21 .

Чтобы избежать этого, в настоящее время для отщепления сульфенильных групп используют нуклеофилъные реа- 30

2 генты 31, которые расщепляют сулвфениламидную связь без образования реакционноспособного катиона сульфенилйя; для препаративного применения используют тиоамиды, например тио.ацетамид, тиобензамид.

Реакцию проводят в органическом растворителе в присутствии кислоты.

На 1 моль Нфс-пептида или Нфс-аминокйслоты (содержащих одну Нфс-группу) используют 2 3, 3 или 4 2) моль тиоацетамида.

Недостатком известного способа является исп»ользование боЛьшого избытка тйоацетамида, что затрудняет выделение и очистку деблокироваииого пептида или аминокислоты после отщепления Нфс-группы.

Цель предлагаемого изобретения .— упрощение процесса удаления нфс-защитных групп.

Поставленная цель достигается описыэаемым способом отщепления сульфенильных групп от N-сульфениламино-.: кислот и N-сульфенилпептидов путем действия на затдищенные по тиольной функции И-сульфениламинокислоты й-сульфенилпептиды тиоамндом в среде органического растворителя в присут ствии кислоты, заключающийся в том, 767090

Пра — Пей — Гли —. ННЕ

Нрс - Tup иле — оне, + Нфс — цис(Трт) — ОП Р (r ) нФс — Цис(тря) — про — лей - nu — ннне (2)

Т) + тиабензакид и

2) + нц>с — Асн — аьр

Н ас- Асн — Цис(Трл) — Пра — Лей- Гли — ННЕ (д)

1) + тиабенаанид

2)+ Паас-Гли-ОПр И)

Глн- Ясн — цис (Tpm) про- лей - Гли- h í2 (Ю) {5) ЩОЕ- Тир-ИлЕ-Оне 1) + анобеныиюо"

{2) t 2) + Илр(ТрТ )» ОПф (8) Nnp(Tpm) — Тир-Иле- Оне (и елоие) (Э) Ипр (Трт) — Тир - Иле- ОН Нре—

+ muo&esarrud и

enp(rpm) — Тир- Иле- Глн — Асн Г 4ис (Tpm) — Пра -Лей - rnu -Мне

) + Йод./ВО% иксисноя кослан о

MnP — ТиР— ИЛЕ- ГЛН вЂ” АС вЂ” ЦиС вЂ” ПРΠ— ЛЕй - ГЛи- ННе

На 1 моль Нфс-пептида израсходовано 0,5-0,6 моль тио» бензамида. что количественно отщепляют сульфенильную группу действием 0,5-0,6 моль тиоамида на 1 моль й-сулье енильного производного. Предпочтительным вариантом спосо-. ба является использование в качестве сульфенильной группы о-нитрофенилсульфенильной группы в качестве тиоамида-тиоацетамида и тиобензамида, для защиты тиольных функций используют 5-тритильную группу.

Реакцию проводят в инертном растворителе или смеси инертных растворителей в присутствии слабой кислоты (предпочтительно уксусной) для протонирования аминопептида, наприМер, этанол — -уксусная кислота, этанол — этилацетат — уксусная кислота.

Температура проведения реакции может быть в пределах от 0 до 40 С, о но предпочтительна комнатная, время проведения реакции 0,5-24 ч,обычно

2-3 ч. Обработку реакционной смеси после отщепления Нфс-группы проводят согласно стандартным методам пептидного синтеза.

Спбсоб позволяет сократить расход тиоамида более чем в два раза (4-8 раз) по сравнению с известными способами отцепления Нфс-группы тиоамидами )1j и (2) .Экономия реагента облегчает выделение целевого продукта и имеет особо важное значение.при отщеплении Нфс-группы и Нфс-аминокислот после их разделения на энантиометры различными методами (при получении оптически активных аминокислот из рацематов) ..

В качестве примера использования тиоамида (тиобензамида) в количестве

0,5-0,6 моль на 1 моль Нфс-соединения приведена методика синтеза дезаминоокситоцина, высокоактивного аналога"пептидноЬо гормона окситоцина. Все пррмежуточные продукты, получаемые после отщепления Нфс-группы, могут быть использованы также для синтеза окситоцина или других

его аналогов. В качестве S-защиты применена S"òðèòèëüíàÿ группа, однако могут быть использованы также

S-ациламинометильные группы.

Дезаминоокситоцин синтезирован из двух блоков, N-концевого трипептида и С-концевого гексапептида (3+6), которые получены поостаточным наращиванием пептидной цепи при помощи пентафторфениловых (Опф) эфиров

Нфс-аминбкислот и Опф-эфира S-тритил-2-меркаптопропионовой кислоты. Со15 единения 1-10 (см.схему), Опф-эфиры, получаемые из соответствующих кислот, дициклогексилкарбодиимида (ДЦГК) и пентафторфенола, могут быть применены для образования пептидной связи

gp также без их выделения в индивидуальном виде, как в данном примере в случае производных L-глутамина, L-тирозина и N — концевого трипептида.

Активированные эфиры тирозина со свободной гидроксильной группой; склонны к межмолекулярной конденсации, а активированные эфиры глутамина претерпевают внутримолекулярную циклизацию с образованием прои водных глутаримида.

Для ускорения завершения реакции образованйя пептидной связи (аминолиза пентаФторфениловых эфиров) к реакционной смеси добавляют 0,5-0,7 эквивалентов третичного основания

З5 (И-метилморфолина), которое частичнс нейтрализует выделяющийся в реакции кислый пентафторфенол.

На последней стадии синтеза разбавленный раствор дитритилдезамино4р оксицина обрабатывают иодом и получают дезаминоокситоцин

767090

Использованы следующие сокращения:

Нфс — о-нитрофенилсульфенил, 2-нитр фенилсульфенил, о-нитрофенилтио; (Трт) вЂ, S-тритилр

ОПФ вЂ” пентафторфениловый эфир;

НОПФ- пентафторфенол;

ДЦКГ- дициклогексилкарбодиимид;

Асн-, -Гли-, -Глн-, -Иле-, -Лей-, -Про-, -Тир-, -Цис-, Мпр — соответственно (.-аспарагинил, глицил, L-глутаминил, (-изо. лейцил, L-лейцил, L-пролил, L-тирозил, L-цистеинил, 2-меркаптопропионил.

Синтезированный дезаминоокситоцин проверен на оптическую чистоту путем анализа летучих производных (й-трифторацетилизопропиловых эфиров) аминокислот гидролизата дезаминоокситоцина газо-жидкостной хроматографией с использованием оптически активной стационарной фазы (циклогексилового эфира М-трифторацетил-(.-норвалил-L-норвалина). Примеси 0-изомеров не превышали 0,5%, включая производного изолейцина.

При характеристике продуктов температуры плавления определяют в открытых капиллярах без поправки, чистоту продуктов проверяю с помощью тонкослойной хроматографии на силикагеле (пластинки "Силуфол",Kavafier, ЧССР), при этом используют следующие хроматографические системы: (1) бензол, (2),эфир, (3) этилацетат, (4) хлороформ+метанол+уксусная кислота 85+10+5 (мл), (5) н-бутанол+уксусная кислота+

+вода 4+1+1 (по объему). .Для .полупрепаративной хроматографии (при очистке веществ для элементного анализа) также использован силикагель.Применяемые в синтезе 0,1 M раствор серной кислоты, 0,2 М, раствор гидрогенкарбоната натрия, 2 М раствор карбоната натрия являются водными растворами.

Пример 1. Пентафторфениловый эфир о-нитрофенилсульфенил-5-тритил-L-цистеина, Нфс-Цис(Трт)-ОПФ(1).

K раствору 12,1 r (23,4 м моль,мм) о-нитрофейилсульфенил-S-тритил-L-цистеина в 30 мл диоксана охлажденному до 15С C добавляют смесь, состоящую из 8,2 мл ЗМ раствора ДЦГК в диоксане и 8,2 мл 3 M раствора пентафторфелола в диоксане. Реакционную смесь перемешивают 3 ч, выпавший осадок

° дициклогексилкарбамида отфильтровывают и промывают его на фильтре диоксаном (3<10 мл). Фильтрат упаривают до маслообразного остатка, который пе- ремешивают с петролейным эфиром (2<50 мм) . Растворитель отделяют декантацией, после последней промывки остаток дополнительно сушат в вакууме (40 С,0,1 мм рт.ст.).Выход затвердевшего пентафторфенилового эфира (Т» 15,1 r (90%)) т.пл.70-72 С;

R 0,75 (I).

Небольшую часть (0,5 r) пентафторфенилового эфира (Т) растворяют в

-бензоле (2,5 мл)и раствор наносят на колонку (3 12 см), наполненную силикагелем, и элюируют бензолом. Собирают первую фракцию, окрашенную в желтый цвет, упаривают (40оС) в вакууме растворитель, остаток растирают с петролейным эфиром (2 10 мл) и сушат в вакууме над пятиокисью фосфора и гидроокисью натрия. Выход

t5 Нфс-Цис(Трт)-ОПФ в процессе хроматографии 80%; т.пл. 77-.79ОС(о(о

12,0 (с 0,5; диоксан) .

Найдено, Ъ : С 60,10; Н 2,95;

М 4,02.

;ф С5 Н Р8М204 9682,69) .

Вычислено,Ъ: С 59,82; Н 3,40; и 4,10. о-Нитрофенилсульфеиил-S-тритил-L-цистеинил-L-пролил-L-лейцилглицил . амид Нфс-Цис(рт)-Про-Лей-Гли-МН (2).

К раствору 14,0 г (20,5 мм)Нфс-Цис(Трт)-ОПФ (1) в 40 мл диоксана, охлажденному до 15 С, добавляют рас твор 5,8 г (20,5 мм) -пролил-L-лейцилглициламида в 20 мл диметилформЗО амида. Смесь перемешивают 0,5 ч, затем по каплям добавляют 1,6 мл (70%) . й-метилморфолина и оставляют на ночь при комнатной температуре.

Растворители упаривают в вакууме, остаток растирают с этилацетатом (100 мл) . Этилацетатный раствор последовательно промывают !3 30 мл)

0,1 M раствором серной кислоты, водой, 0,2 И раствором гидрогенкарбо4() ната натрия, водой, сушат над сульфатом натрия и упаривают (40оC) этилацетат в вакууме. Оставшееся масло перемешивают(35оС )с петролейным эфиром (2х30 мл).

Растворитель отделяют декантаци ей, а после последней промывки остаток сушат в вакууме. Выход желтого тетрапептида 2) 14,4 г (90%);т.пл.

120-122 С;(о 3 — 62,2 (c 1,0; диоксан); R 0 55 (4), 0,86 (5) .

Найдено, % : С 62,54; Н 5,74; и 10,26.

С4 Н4ь М60 5 (782,99) .

Вычислено, Ъ: С 62, 89; H 5, 92; и 10,73. о-Нитрофенилсульфенил-L-аспарагинил-S-тритил-L-цистеинил-L-пролил-L-лейцилглициламид, Нфс-Цис(Трт)-Про-Лей-Гли-МН (3).

К раствору 14,3 r (18,3 мм) Нфс60 -Цис(Трт)-Про-Лей-Гли-NH<(2) в 60 мл этанола добавляют 1,4 г (10 мм)тиобензамида и после растворения реагента З.мл уксусной кислоты. Смесь выдерживают при комнатной температуре

65 3 ч, отфильтровывают, выпавший жел-

I тый осадок побочных продуктов.филь- диоксане и 21,4 мл (64,0 мл) 3 М растрат упаривают э вакууме, остаток твора пентафторфенола в диоксане. растворяют в смеси, состоящей из Реакционную смесь перемешивают при

20 мл эфира и 100 мл 0,1 М раствора 15 С б ч, причем желтый осадок о-нисерной кислоты. Эфирный слой отделя- трофенилсульфенил-L-глутамина раствоют, водный слой, содержащий сульфат ряется и выпадает осадок дициклогекаминотетрапептида, экстрагируют эфи- силкарбамида, который отфильтровываром до бесцветного эфирного слоя ют промывают на фильтре диоксаном

I о (5х20 мл) и при 5оС добавляют 2М, (3 10 мл) и фильтрат упаривают (35 С) раствор карбоната натрия до рН рас- в вакууме до маслообразного остатка. твора 9,0. Отделяют выпавшее масло К остатку добавляют эфир (50 мл) аминотетрапептида и промывают его 0 отфильтровывают малорастэорнмый в водой (2x10 мл). Водный слой допол- эфире осадок (1,0 г). нительно экстрагируют (Зх20 мл) сме- Данные элементарного анализа осадсью, состоящей из хлороформа и зтано- ка согласуются предположением, что ла 10+1 (по объему), которую добав- осадок является имидом о-нитрофенилляют к маслу аминотетрапептида.После 15 сульфенил-(.-глутаминовой кислоты. упаривания (35 С) органических рас- Найдено,Ъ : С 47,48; Н 4,09; творителей к твердому остатку (11 г, N 14,33.

16,5 мм, 90%) аминотетрапептида до- . Вычислено для имйда о-нитрофенилбавляют 50 мл диоксана, 7,5 г сульфенил-L-глутаминовой кислоты. (16,5 мм) пентафторфенилового эфира 20 С „, Н „N>04 S (281,29) -o: о-нитрофенилсульфенил-L-аспарагина и С 46,97; Н 3,94; и 14,94. после растворения компонентов при Вычислено для Нфс-Глн-ОПф

15 С добавляют 0 9 мл (8 мм)N-метил- C,v Н g Гз N OS S (465, 36), Ъ: морфолина. Смесь перемешивают 5 ч, С 43,88; Й 2,60; N 9,03; упариэают (40 C) растворители. Оста- т.пл. 159оС (разлож.);8 0,35 :, 2) ток растворяют в 100 мл этилацетата 0,70 (3}. и раствор последовательно промывают Согласно ИК-спектроскопии нитриль(Зх20 мл) 0,1 М, раствором серной ная группа отсутствует. кислоты водой, 0,2 M раствором гидро- Эфирный раствор упаривают до негенкарбоната натрия, водой, сушат большого объема и добавляют петронад сульфатом натрия и упариэают З лейный эфир (80 мл). Выпавшее масло о (40 C) этилацетат в вакууме. После растирают с петролейным эфиром растирания остатка с эфиром (2x30 мл) (2> 30 мл) . Растворитель удаляют сливыход пентапептида (3) 13,9 г (90% ванием, а после второй промывки упаиз расчета на аминотетрапептид; 85% риэанием (35 C) в вакууме. Выход из расчета на .защищенный тетрапептид);З третьего пентафторфенилового эфира т.пл. 133-134 C; Rg 0,10 (4), 0,60 о-нитрофенилсульфенил-L-глутамина, о (5) . Нфс-Глн-ОПФ (4) 7 г (70%) Р 0,05 (2)

Небольшую часть (0,3г) защищенного 0,45 (3). В отличие от эмида о-нитропентапептида (3) растворяют в.этано- фенил-сульфенил-L-глутаминовой кисле (3 мл) и раствор наносят на колон- 40 лоты, активированный эфир Нфс-Глнку (3 х 12 см), наполненную силикаге- ОПФ подобно остальным активированлем. Элюируют этанолом, первую фрак- ным эфирам,- быстро реагирует со цию, окрашенную в желтый цвет отбра- спиртовым раствором аммиака. сывают; собирают вторую, основную К раствору 13,8 г (15,4 мм)защижелтоокРашеннУю ФРакцию, УпаРивают . щенного пентапептида (3) в 60 мл о (40 С) растэоритель и остаток расти- этанола добавляют 1,2 г (8,5 мм) рают с эфиром (2"10 мл). Выход очитиобензамида и после растворения рещбнного защищенного пентапептида агента 3 мл уксусной кислоты. Смесь о . 2О

85ь; т.пл. 137-139 С;ф) 62,9 (с Ою5 выдерживают IIpH комнатной температу ре 3 ч и отфильтровывают выпавший

Найдено, % : С 59,85; Н 5,61;

0 желтый осадок побочного продукта.

N 12,20; Фильтрат упаривают(40 С) в вакууме, С45 Н52 Н2ОРЯ2 (8 97, 0 9 ) . остаток растворяют в смеси, состояВычислено,Ъ: С 60,25; Н 5,84; щей из 20 мл эфира и 85 мл 0,1 М

М 12,49. раствора серной кислоты. Эфирный

П Р и м е Р 2. о-НитРофенилсуль- 55 слой, содержащий бензонитрил, отбрафенил-Е-глутаминил-L-аспарагинил-S- сыэают, водный слой промывают эфиром

-тритил-L-цистеинил-L-пролил-L-лей- до бесцветного эфирного слоя {5 20мл), цилглициламид, Нфс-Глн-Асн-Цис{Трт}— потом при 5оС добавляют 2 М раствор

-Про-Лей-Гли-МН (5). карбоната натрия до рН раствора раэВ 30 мл диоксана суспендируют 60 ным 9,0. Отделяют выпавшее масло

6,4 r (21,4 мм) о-нитрофенилсульфе- аминопентапептида Асн-Цис(Трт) -Пронил-L-глутамина, суспензию охлаждают Лей-Гли-NHg и промывают его водой до 15 C и к ней добавляют смесь, со- (2<10 мл) . Объединенный водный слой стоящую из 7,4 мл (22,4 мм) 3 М рас- дополнительно экстрагируют (3 20 мл) твора дициклогексилкарбодиимида, а в $$ смесью, состоящей из хлороформа и

767090

10 этанола 10+1 (по объему), которую добавляют к маслу аминопентапептида.

После упаривания органических растворителей к твердому остатку (10,7 г, 13,8 мм, 90Ъ) аминопептапептида добавляют 25 мл диметилформамида, 25 мл диоксана и после растворения 6,4 r (13,8 мм) Нфс-Глн-ОПф (4). Смесь перемешивают при комнатной температуре 0,5 ч, потом при 15 C добавляют

0,8 мл (7,0 мм) М-метилморфолина и перемешивание при комнатной температуре продолжают 5 ч. упаривают растворители. Остаток растворяют в 100 мл этилацетата и раствор последовательно промывают (3 20 л) 0,1 M раствором серной кислоты, водой, 0,2 М 15 раствором гидрогенкарбоната. натрия, водой, сушат сульфатом натрия и упаривают. (40 С) этилацетат в вакууме.

Выпавший во время экстракции осадок получаемого защищенного гексапептида щ (5) добавляют к остатку после упаривания этилацетата. Остаток растирают с эфиром (50 мл) и сушат в вакууме над пятиокисью фосфора и гидроокисью натрия. Выход .защищенного гексапептида (5) 13,4 r (90Ъ из расчета нг аминопентапептид; 85Ъ из расчета на защиШенный пентапептид); т.пл.

100-102 С (NQ 43,7 (с 1,0; диоксан);R 0,03 (4), 0,38 (5).

Найдено, Ъ : С 57,14; Н 5,69;

М 13,70.

С8оНьо МюОю5 (1025 23) .

Вйчисле йо, Ъ : С 58, 58; Н 5, 90;

М 13,66.

Пример 3.Метиловый эфир о-нитрофенилсульфенил-(.-тирозил-L-изолейцина, Нфс-Тир-Иле-ОМе (6).

К раствору 7,4 г (22 мм) о-нитрофенилсульфенил-L-тирозина в 20 мл диоксана при 15 С добавляют смесь, 40 состоящую из 8 мл 3 M раствора дициклогексилкарбодиимида и 24 мл 3 М раствора пентафторфенола в диоксане (избыток пентафторфенола берется для подавления побочной реакции феноль ной гидроксильной группы тирозина с

ДЦГК). Перемешивают 5 мин, добавляют раствор 3,5 r (22 мм) свежеприготовленного метилового эфира L-изолейцина в 15 мл диоксана и реакционную 5О смесь перемешивают 2 ч при комнатной температуре. Ро каплям добавляют

5,5 мл (50,мм)М-метилморфолина и смесь оставляют на ночь при комнатной температуре. Отфильтровывают выпЬвший осадок дициклогексилкарбамида, фильтрат упаривают в вакууме до маслообраэного остатка, который растворяют в 100 мл этилацетата, и полученный раствор последовательно промывают (Зк30 мл) 0,1 М раствором QQ серной кислоты, водой, 0,2 N раствором гидрогенкарбоната натрия, водой, сушат сульфатом натрия и упаривают этилацетат в вакууме. Темно-желтое масло перемешивают (-35 C) с петро- g5 лейным эфиром (2 30 мл). Растворитель удаляют сливанием, а после второй промывки осадок дополнительно сушат в вакууме. Выход твердого эашищенного дипептида (6) 9,5 г (85Ъ),"

R 0,45 (2) .

Небольшую часть(0,5 г)дипептида растворяют в бензоле (2 мл)и раствор наносят на колонку (3«12 см), наполненную силикагелем. Элюируют бензолом до бесцветного элюата,потом эфиром вымывают основную фракцию.упаривают эфир и желтый остаток растирают с петролейным эфиром (2 5 мл).

Выход защишенного дипептида после хроматографии 82Ъ; т.пл.109-110 С; о — 3,4 (с 1,0; диоксан).

Йайдено, Ъ : С 57,35; Н 6,25;

М 8,50.

С Н, 7М О65 (461,54) .

Вычислено,Ъ С 57 25; Н 5 90;

М 9,10.

Пентафторфениловый эфир S-тритил-2-меркаптопропионовой кислоты, Мпр,Трт)-ОПф (7).

К суспензии 8 r (23 мм) S-тритил-2-меркаптопроьионовой кислоты (приготовленной при взаимодействии 2-меркаптопропионовой кислоты с трифенилкарбинолом в среде уксусной кислоты) в 50 мл диоксана добавляют смесь, состоящую из 8 мл 3 И раствора ДЦГК в диоксане и 8 мл 3 М раствора пентафторфенола в диоксане. Реакционную смесь перемешивают 6 ч при комнатной температуре. За это время осадок S-тритил-2-меркаптопропионовой кислоты постепенно растворяется и выпадает осадок дициклогексилкарбамида, который отфильтровывают и промывают диоксаном (3 10 мл). Фильтрат упаривают в вакууме до маслообразного остатка, добавляют 50 мл петролейного эфира и оставляют при О С на 24 ч. Отфиль-, тровывают выпавший осадок пентафторфенилового эфира (7) и сушат его в вакууме над пятиокисью фосфора и гидроокисью натрия. Выхоц пентафторфенилового эфира (7) 10,5 г (90Ъ); т.пл. 77-79 C;. R . 0,85 (1)(желтое пятно после опрыскивания пластинки трифторуксусной кислотой)..

После перекристаллизации из метанола т.пл. 82-83 С. о

Найдено, Ъ : С 65,74; Н 3,66;

М 0,12.

С2ВН 9 N O S (514,52) .

Вйчислейо,Ъ: С 65,36; Н 3,72;

М 0,10.

Метиловый эфир 5-тритил-2-меркаптопропионил-L-тироэил- -изолейцина, Мпр(Трг)-Тир-Иле-Оме (8) .

К раствору 9,2 г (20 мм)защищенного дипептида (6) в 40 мл этанола добавляют 1,5 r (11 мм) тиобенэамида и после растворения реагента

2 мл уксусной кислоты. Смесь выдерживают при комнатной температуре

767090

12 3 ч и отфильтровывают выпавший жел1 тай осадок побочных продуктов. Фильтфат упаривают в вакууме, остаток растворяют в смеси, состоящей из

30 мл эфира и 105 мл 0,1 N раствора серной кислоты. Эфирный слой отделяют, водный слой раствора сульфата аминодипептида Тир-Иле-ONe экстрагируют,эфиром до бесцветного эфирного слоя (5х30 мл), потом при 5оС добавляют 2 М раствор карбоната натрия до рН раствора равным 9,0. Выпавшее масло аминодипептида экстрагируют этилацетатом (2х20 мл) . Этилацетатный слой промывают водой (2к20 мл), сушат сульфатом натрия и растворитель упаривают в вакууме. Остаток масла (5,9 г, 18 мм, 90Ъ) растворяют в 30 мл диоксана и при 15 С к раствору добавляют 9,3 г (18 мм)

Мпр(Трт)-ОПф (7),; После растворения активированного эфира прикапывают 1,3 мл (13 мм) N-метилморфолина.

Смесь перемешивают б ч при комнатной температуре, упаривают растворитель и остаток растворяют в 100 мл этилацетата. Этилацетатный раствор последовательно промывают (Зк 20 мл), 0,1 M раствором серной кислоты, водой, 0,2 М раствором гидрогенкарбоната натрия, водой, сушат сульфатом натрия и упаривают этилацетат в вакууме. Маслообразный остаток перемешивают (35ОС) с петролейным эфиром (2х50 мл) . Растворитель удаляют сливанием, а. после второй промывки дополнительно упариванием в вакууме.

Выход твердого защищенного трипептида Мпр(Трт)-Тир-Иле-ONe (8) 10,8 г 90Ъ из расчета на Мпр(Трт)-ОПф;

88Ъ из расчета на Нфс-Тир-Иле-ОМе ; т.пл.108-110 C; R 0,42 (2) (оранжевое пятно после опрыскивания пластинки реактивом Паули) ,После переосаждения из эфира петролейным эфиром т.пл. 110-111" С;

R о(— 4,2 (с 1,0 диоксан) .

Найдено, Ъ : С 71,06; Н 6,61;

N 4,26.

С Н42 NgO@ S (6 38, 8 3)

Вычислено,Ъ: С 71,45; Н 6,63; и 4,38.

S-Тритил-2-меркаптопропионил-L-тирозил-l-изолейцин, Мпр(Трт)-Тир-Иле (9).

10,7 r (16,7 мм) метилового эфира трипептида (8) растворяют в 60 мл диоксана и при комнатной температуре (20 С) при перемешивании добавляют

33,4 мл 0,5 М раствора гидроокиси натрия, потом по каплям в течение

2 ч еще 37 мл 0,5 М раствора гидроокиси натрия. Смесь перемешивают в течение 0,5 ч, потом добавлением

1 М раствора серной кислоты доводят реакцию среды до рН равным 7,0 и упаривают (35 C) растворитель до 1/4 .начального объема раствора. Остаток доводят водой до 60 мл, добавлением

2 М раствора карбоната натрия устанавливают рН 8,0 и этилацетатом (Зх15 мл) экстрагируют остатки неомыленного метилового эфира трипептида (8). Водный слой, содержащий натрие5 вую соль кислоты трипецтида Мпр-(Трт)

-Тир-Иле-ONa, при 5 С подкисляют

1М рН

3,0. Выпавшее масло кислоты трипептида (9) экстрагируют этилацетатом (Зх50 мл). Этилацетатный слой промывают водой (3«20 мл), сушат над сульфатом натрия .и растворитель упаривают в вакууме. Маслообразный остаток переосаждают из эфира (20 мл) добавлением петролейного эфира (60 мл).

15 Отфильтровывают осадок, промывают его на фильтре петролейным эфиром (2х20 мл) и сушат в вакууме (0,1 мм рт.ст.) Выход трипептида (9)

7,4 r (70Ъ)(2); т.пл. 148-150 С о<) 7,2 (с 0,5; диоксан); Rg 0,30 (2) (оранжевое пятно после опрыскивания пластинки реактивом Паули) .

Найдено, Ъ : С 70,87; Н 6,37;

М 4,48.

С,7 Н„о Н 05 5 (624,81) .

Вычислено,Ъ: С 71,13; H 6,45;

Н 4,48.

Пример 4.. S-Тритил-2-меркаптопропионил-L-тирозил-L-изолейцил- -глутаминил-L-аспарагинил-S-тритил- -цистеинил-L-пролил-L-лейцилглициламид,Мпр(Трт)-Тир-Иле-Глн-Асн-Цис(Трт)-Про-Лей-Гли-NH< (10).

К раствору 13,3 r (13 мм)защищенного гексапептида (5) в 60 MJi этано ла добавляют 0,93 г (6,7 мм) тиобензамида и, после растворения реагента

3 мл уксусной кислоты. Смесь выдерживают при комнатной температуре Зч и отфильтровывают выпавший осадок

40 побочных продуктов. Фильтрат упаривают в вакууме, остаток растворяют в смеси, состоящей из 20 мл эфира и

75 мл 0,1 М раствора серной кислоты.

Водный слой экстрагируют эфиром до бесцветного эфирного слоя (5к20 мл), потом при 5ОC добавляют 2 М раствор карбоната натрия до рН водного слоя

9,0. Отделяют выпавшее масло аминогексапептида Глн-Асн-Цис(Трт) -Ppo"

-Лей-Гли-NH и промывают его водой

1 (2х10 мл). Водные слои дополнительно экстрагируют (Зх 20 мл) смесью, состоящей из хлороформа и этанола

10+1 (по объему), которую добавляют к маслу аминогексапептида. Быстро упаривают(30ОC)органические растворители, твердый остаток (10,7 г, 11,7 мм, 90Ъ) аминогексапептида при

О C растворяют в 30 мл диметилформамида, добавляют раствор 7,3 г

5Q (11,7 мм) кислоты трипептида (9) в

20 мл диоксана и еще смесь, состоящую из 4 мл 3 N раствора ДЦГК в диоксане и 12 мл 3 М раствора пентафторфенола в диоксане. Смесь оставляют при 10 С на ночь.

767090

Отфильтровывают выпавший осадок дициклогексилкарбамида, промывают

его на фильтре диоксаном (Зх10 мл).

Фильтрат упаривают в вакууме до маслообразного остатка, к которому добавляют 50 мл эфира. Отфильтровывают осадок зацищенного нонапептида (10), промывают его эфиром (Зх-10 мл) и сушат в вакууме над пятиокисью фосфора и гидроокисью натрия, Выход защищенного нонапептида (10) 13,4 г (78% из расчета на кислоту трипеп- ® тида; 70% из расчета на защищенный гексапептид);т.пл. 148-1500C; Rg

0,04 (4) 0,67 (5) (обнаружение реактивом Паули и хлорбензидиновым реактивом) . 15

Небольшую часть (0,5 г) защищенного нонапептида (10) растирают горячим этанолом (5 мл). После охлаждения отфильтровывают осадок (0,4 r) и растворяют его в метаноле (5 мл). 2{)

Метанольный раствор защиценного нанапептида наносят на колонку (3 х х12 см) наполненную силикагелем,и элюируют метанолом (50 мл). Фракции, которые, согласно анализу тонкослойной хроматографией, содержат зациценный нонапептид,объединяют, растворИтель упаривают в вакууме, Остаток ра.стирают с эфиром потом водой и сушат ! в вакууме над пятиокисью фосфора и гидроокисью натрия..Выход зацищенного нонапептида при очистке 50-o) т.пл.154-155 С;3< ) 35,5 (с.0,5; диоксан).

Найдено, Ъ : С 65 58; Н 6 40;

N 9,99.

СЬ Нс)5 МцО Sq (1478 86).

Вычислено,Ъ: С 65,79; Н 6,47;

N 10,42.

Циклический дисульфид (1-6) 2-меркаптопропионил-L-тирозил-L-иэолей- 4{) цил-L-глутаминил-L-аспарагинил-{.цис" теинил-L-пролил-L-лейцилглициламида дезаминоокситоцин, Мпр-Тир-Иле-Глн-Асн-Цис-Про-Лей-Гли-NH< (11).

2,21 г (1,5 мм) защищенного нонапептида (10) растворяют в 2 л 80Ъ-ного водного раствора уксусной кисло-, ты и в один прием добавляют раствор

0,9 г (7,0 мг-атомов) иода в 0,2 л

80%-ного водной уксусной кислоте.

Смесь перемешивают при комнатной температуре 1 ч. Затем желто-коричневый раствор титруют 0,1 М водным раствором двуокиси серы до обесцвечивания, .и упаривают (30 С) в вакууме до 1/5 части начального объема.

Раствор пропускают через колонку, наполненную анионитом AB 17х 8 в 0Н или ацетатной форме (20 мл) . Анионит промывают водой (3 20 мл) и объединенный элюат упаривают до небольшо- фО

ro объема (5 мл) и лиофилизируют.

Полученный порошок, содержащий дезаминоокситоцин и трифенилдикарбинол, растирают с эфиром (3 10 мл) и остаток (1,1 r) очицают распределительНфс-Глн-Асн-Цис(Трт)-Про-Лей-Гли-амид

103 0,04 (4) Нфс-Асн-Цис(Трт)-Про-Лей-Гли-амид

90 0,10 (4) Нфс"Цис(Трт)-Про-Лей-Гли-амид

78 0,05 180 (3) Нфс-Тир-Иле-ОМе

46 0 05 (1) 60

Хроматографические системы: 1 бензол, 2 - эфир, 3 — этилацетат, 4 — хлороформ — метанол — уксусная кислота 85+10+5 (мл); Rg тиобензамида „ желтое пятно 0,5 (1);0,65 (2);0,72 (3);0,83 (4). ной хроматографией на Сефадексе

G-25 в системе н-бутанол+бензол+вода содержацей 3,5%-ной уксусной кисло- ты и 1,5% пиридина (1+1+2). Выход деэаминоокситоцина (11) 0,44 r (30% из расчета на защищенный нонапептид) т.пл. 176-182 С;(о{ - 90 (с 0,5;

1,0 N водный раствор уксусной кислоты). Утеротоническая активность у крыс (в отсутствии ионов магния)

600170 международных единиц в мг. вещества.

Пример 5. Уточнение времени отцепления Нфс-группы у Нфс-пептидов.

100 мкмоль соответствующего пептида (см.таблицу) растворяют в

0,4 мл этанола, добавляют 8 мг (58 мкмоль) тиобензамида и 0,02 мл уксусной кислоты. Смесь выдерживают при комнатной температуре (20 С)и с интервалами 10 мин берут 1 мкл раствора и проводят хроматографирование на пластинках "Силуфол". Для сравнения проводят хроматографирование эталонного раствора, содержащего 5 мкмоль пептида в смеси 0,4 мл этанола и 0,02 мл уксусной кислоты.

Время отцепления НФс-группы (не более 95% исходного Нфс-пептида) определяют сравйением экстинкций желтых пятен ТСХ исходных пептидов и эталонного раствора. Сравнение проводят при помощи прибора йт 65 М (ГДР) с фильтром 400 нм.

7090 .

Составитель В.Волкова

Редактор Л.Герасимова Техред М. Кузьма: КорректоРГ. Назарова

Заказ 7126/19 Тираж 495 Подписное

ВНИИПИ Государственнбго комнтета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Филиал ППП "Патент", г.ужгород, ул.Проектная,4

76

Пример 6. .Отщепление Нфс. -группы от Нфс-аминокислоты действи ем тиобензамида или тиоацетамида.

28 мг (100 мкмоль) Нфс-L-лейцина растворяют в 0,4 мл этанола, добавляют 8 мг (58 мкмоль) тиобензамида и 0,02 мл уксусной кислоты. Время отцепления Нфс-группы определяют,как описано ранее, оно составляет менее

10 мин.(RE Нфс-L-лейцина в системе (2) 0,81. Опйт отщеплейия"Нфс-группы у Нфс-L-лейцина повторяют с 4,4 мг ,(59 мкмоль) тиоацетамида. Время отщепления Нфс-группы также состайляет менее 10 мин.

Формула изобретения

1, Способ отщепления сульфенильных групп,от N-сульфениламинокислот и й-сульфенилпептидов путем дейст- вйя"на защищенные по тиольной " фуйкции й-сульфениламинокислоты и

N-сульфенилпептиды тиоамидом в среде органического растворителя в присут ствии кислоты, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью упрощения процесса, используют 0,5-0,6 моль тиоамида на 1 моль N-сульфенильногс .производного.

2. Способ по п,1, о т л и ч а ю шийся тем, что в качестве суль16 фенильной группы отщепляют о-нитрофенилсульфенильную группу.

3. Способ по п.1, о т л и ч а юшийся тем, что в качестве тиоамида используют тиоацетамид или тиобензамид.

4. Способ по п.1, о т л и ч,а ю шийся тем, что используют

N-сульфениламийокислоты и N-сульфе-. нилпептиды, защищенные по тиольной функции S.-тритильной группой.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1.Synthese чоп Pept den, (Hg.E.Wtinsh), Теi1 1, "Hethoden der

Огдап1schen chemiе", Houben Weil, 15 (Hg.Е.И011ег), Bd 15/1, G.Thieme, Stu taart, 1974, с.203.

2. Иогодег L;,Harchiori F.,Boãin G., Scoffone Å. Stud.ies on cytochrome

С.Part н, S ynthesis of the РгоЩ tected Heptapeptide (Sequence 17-23)

of Baker> s Jast 1so-l-cytochromec, Вiоро1ymers, 1973, 12,с.493 (прототип). 3. Kessler W.,iselln В;,Selektive

5рв1 ипд subt 1tuiey ter Phenylsylfeny1-Schutigruppen bei Peptidsyn-. thesen He1v Chim,Àcta, 1966,49, с.1330.