-а цилированный пентапептидамид или его динатриевая соль, обладающие способностью природного гастрина стимулировать выделение желудочного сока
ОПИСАНИ-Е
ИЗОБРЕТЕН ИЯ (ii)624911
Союз Советских
Социалистииескин
Республик (61) Дополнительное к авт, свил-ву— (22) Заивлеио07.06.76 (21) 2387222/23-04 с присоединением заявки № (23) Приоритето†(43) Оиубликовано25.09.78 Бюллетень № 35 (45) Дата опубликовании описании 01.09.78
2 (51) М. Кл
С 07 С 1 03/52
А 61 К 31/195
«тосударотвенны9 юатет
Совета Министров СССР ов делан изооретений н открытий (53) УЙК 547.964, .4(088,8) (72) Авторы изобретении
П. Я. Романовский, Т. N. Шевелева, И. К. .Лнепкаула, В. Э. Муйжниекс и Г. И, Чипенс
Ордена Трудового Красного Знамени институт органического синтеза AH Латвийской ССР (71) Заявитель (54) Й -AUHJIHPOBAHHbIA НЕНТАПЕПТИДАМИД ИЛИ ЕГО
ДИНАТРИЕВАЯ СОЛЬ, ОБЛАДАЮШИЕ СПОСОБНОСТЬЮ
ПРИРОДНОГО ГАСТРИНА СТИМУЛИРОВАТЬ ВЫ ДЕЛЕНИЕ КЕЛ ДОЧНОГО СОКА
Изобретение относится к новому биологически активному соединению В литературе известны многочислен- щ ные аналоги-производные С-концевого тетрапептида гастрина (1), наибольшее значение для целей диагностики функционального си:тояния желудка в практической медицине имеет трет-ВОС-производное (2 ) . ВОС-Тгр-МеЛ.- Аьр-Ртте-МИ .И Однако его применение затруднено из-за низкой растворимости в физию ологическом растворе, необходимом для введения соединения в организм. Я -4opMnarmma-Top- Net-they e NH 1П R. обладает в 3 раза более высокой раство», римостью, чем соединение П, недостат- z% ком этого препарата является способ его очистки, который состоит в переосаждении водой из диметилформамида (31. Иель настоящего изобретения - расширение средств воздействия на живой организм, создание HB доступном сырье: с использованием простой технологии нового соединения, обладающего хорошей раст воримостью в воде и физиологическом растворе () 10 мг/мл), что значительно упрощает методику приготовления раствора активного препарата для биологических исследований, кроме того препарат обладает высокой биологической активностью и может быть использован в практической медицине для диагностики функционального состояния желудка. Поставленная цель достигается приме-tтением и -ацилированиого пеитапептида- . мида обшей формулы I сукцинил»саркозил-триптофил-лейцил-аспартил-фенилаланиламип или его динатриевой солью. Синтез И-ацилированного пептида формулы Х осущеспзляется известным мето3 6249 дом, ступенчатым наращиванием цепи ме тодом активированных 4-пиридинальдоксимовых эфиров И -amuraposaalx аминокис; лот (4), начиная с фениламида, Все реакции образования пептидной связи проводят в однотипных условиях, побочные продукты и избыток ацилирующего агента по окончании реакции полностью удаляют экстракasek реакционной смеси кислыми и основ иИЫи водными растворами. Л р и м е р. Органические растворители уцаривали на ротационном испарителе при остаточном давлении 1218 мм рт. ст. и температуре бани 15 Q O С. Температуры плавления (разложения) определяли в открытых капиллярах (без коррекции), углы вращения - на поляриметре Леркин Злмер» (модель 141). ИК-спектры образцов снимали на нрнбо ре UR -10 фирмы «Карл Иейсс (ГБ ). Зля хроматографического анализа исполь зовали бумагу Фильтрак ФН-3 (ГДР) в системе н-бутанол- уксусная кислота1 25 вода (4:1 6). Электрофоретический ана11 4 лиз на бумаге Фильтрак ФН-16 (ГЙР) проведен в буферных системах: 30% уксусная кислота (рН 1,9) при потенциальном градиенте 18 в/см и пиридин. ацетатный буфер (pH-5,0) при 9в/см, время - 1,5 час. Электрсфоретическая подвижность соединений (E „-z ) охарак теризована по отнощению к гистидину, Пятна на хроматограммах н электрофореграммах проявляли нингидрином, реактивом Эрлиха и раствором перман а . ната калии в разбавленной серной кислоте. Образцы для элементарного анализа были высушены в течение 10 час в вакуумном эксикаторе над пятиокисыо фосфора и гидроокисью калии. 4-пнридинальдоксим оные эфиры ф -ациламинокислот 4-пиридинальдоксимовые эфиры Н -трет-ВОС-(P-и-нитробензилового эфира)-аспарагиновой кислоты,.N -трет-ВСС-лейпина, М -трет-ВСС-триптофана и Я -карбобензоксисаркозина получены согласно (4 ; аналитические данные, характеризующие полученные соединения, приведены в табл. 1, И о о о CO о. 0 о О о (О Р} (j$ 3 д М а. >, с} 0+ э g0 о «+ х. 62493. 1 t (» о (О х О Ф м И Ig 0 о Я о" «Ф СЦ 0о 7 6249 N -трет-бутилоксикарбонил-аспартил-, -(Р -и-нитробензиловый эфир)-фенил» аланил-амид, К суспензии 1,0 г гидрохлорида фенилаланил-амида в 15 мл тетрагидрофурана добавляют 0,69 мл триэтиламина, 2,4 г Д» -(4-пиридинальдоксимового) Р-п-нитробензилового эфира Я -третбутилоксикарбонил-аспарагиновойrmello ы и 0,3 мл уксусной кислоты, пере- 10 мешивают в течение часа и оставляют на 16 час нри комнатной температуре, Реакционную смесь выливают в 50 мл воды, экстрагируют 50 мл этилацетата,/Органический слой последовательно 1$ .цроьпывают 3 х .20 мл 5% раствора бисульфата калия, 1х20 мл воды, Зх20мл Я% раствора бикарбоната натрия и lõ20 мл воды. ОрганиЧеский слой Высушивают над безводным сульфатом магния„2О упаривают. Сухой остаток кристаллизуют из петролейного эфира. Выход 1,55 г {60%). Т. пл. 158-160 С.Qj = 21,0 С (с 1,0, тетрагидрофуран). Найдено,%: С 58,56; Н 5,93; A 10,31. С о Н 0 0б Вычислено,%: С 58,40; Н 5,84; Ю 10,91. М -трет-бу тил оксикар6онил-лейцил-аспартил (P -и-нитробензиловый эфир)-фе ни цапаний-амид, Растворяют 2,98 .гHOS-Аьр(ОВ ЯМО }-РИ© НН>, в 15 мл трифторуксусной кислоты, выдерживают 20 мин при комнатной тем-" пературе, упаривают в вакууме. К остатку добавляют 50 мл диэтилового эфира, вещество отфильтровывают и высушивают w вщсуумном эксикаторе. 46 Полученное вещество суспендируют в 10 мл тетрагидрофурана и нейтрализуют 0,8 мл триэтиламина и .добавляют 2,5 г 4-пиридинальдоксимового эфира А -трет бужлоксикарбониллейщща и 0,30 мл уксусной кислоты и оставляют на 16 час при комнатной температуре, Выделение продукта аналогично описанному выше. Получают 3,0 г (74%). Т, пл. 167-16УО )/) =33>7W (с 1,0 тетрагидрсфуран), йайдейо,%: С 59,69; Н 6,66;,Й11,00 С> H-«ht,Îö Вычислено,%: С 59,63; H 6,63; N 11,15. N -трет-бутил оксикарбонил-триптофил 55 лейцил-аспартил (Я -п-нитробензиловый эфир)-фенилаланил-амид; Растворяют 2,7 г й>С-LRU-Àéó(овъЕ ко }-р е Кй в 10 л триФто р уксусно@ ll 8 кислоты, выдерживают 20 мин при комнатной температуре, упаривают в вакууме. К остатку добавляют 50 мл диэтилового эфира, вещество отфильтровывают и высушивают в вакуумном эксикаторе над гидроокиськ. калия. Полученное вещество суспендируют в 20 мл тетрагидрсфурана, добавляют 1,1мл триэтиламина и упаривают полученный" раствор в вакууме. Остаток растворяют в 20 мл -.етрагидрофурана, добавляют 2,43 г 4-пиридинальдоксимового эфира Ф -Tpew6ymaoKcMKap6ozap6oamnTpamoфана, 0,6 мл уксусной кислоты и mbдерживают 16 час при комнатной температуре. Выделение продукта аналогично описанному выше. Получают 2,7 г {81%). Т. пл, 169-172 С бЯ .29,2 (с 1,0 тетрагидрофуран) . Найдено,%: С 60,89; Н 6,59; Й 11,96. Сю Н 5101010 аа Вычислено,%: С 60,75 Н 6,44; М 12,02. g --карбобензоксисаркозил.-триптофил-лейцил-аспартил (p -и-нитробензиловый эфир) -фенилаланил-амид „ Растворяют. 2,62 г ЗОС-Тгр-Ьео-Аьр» <(OBzE Й0} - рЬВ И" в 4% растворе меркапто этанола в трифторуксусной кислоте, ВЬИ держивают 10 мин при комнатной температуре и упаривают В Вакууме. К остатку добавляют 30 мл диэтилового эфира, вещество отфильтровывают и высушивают В Вакуумном эксикатореа Полученное вещество суспендируют В 25 мл тетрагидрсфурана, добавляют . 0,83 мл триэтиламина и упаривают полученный раствор в вакууме, К остатку добавляют 20 мл тетрагидрофурана, 1,47 г 4-ниридинальдоксимового эфира карбобензоксисаркозина и 0,3 мл уксусной кислоты и Выдерживают 1 6 час при комнатной температуре. Выделение продукта аналогично описанному Вьпие. Получают 2,56 г (96%). Т, пл, 169-175oC-fr/) =24 8 С (С 1,0 дим етилформамид) . Найдено,%: С 55,89; Н 5,69; V10,77. СМН ЬЯ Вычислено,%: С 56,93; Н 6,08; Й 11,20. Сарк озил-трицт Мил-лейцил-аспартилг -фенилаланин-амид, РастВоряит 1,1 4 г Z Of"=TFp liQU-Asp" 1(ОвхГ ИО }РИАЗ ИИ В 20 мл смеси метанолуксусная кислота-вода (6:1:1), добавляют палладиевый катализатор и гидрируют при атмосферном давлении в течение 10 час. Катализатор отфильтровывают, фильтрат упаривают, к остатку добавляют 5 мл н-бутанола, растирают и отфильтровывают. Вещество на фильтре промывают 5 мл н-бутанола и 30 мл днэтилового эфира. Выход 0,75 г (82%} Е 0,58. (рН 1,9), ЕН 0.52 (pH 5>0) И 0>70>Щ =О>2 "С (с 1,0 уксусная кислота). Найдено,%: С 53,76; Н 7,12; И 12,97 33 4З 1 1 Й Вычислено,%: С 53,6; Н 7,18; И13,28 Сукцинил-саркозил-триптофил-лейцил-аспартил-фенилаланил-амид .. Растворяют 0,325г бсн -Tqp- (au- Aspв 10 мл HHpHl1HHB H добавляют 0,070 г янтарного ангидрида, Реакционную смесь выдерживают 16 час при комнатной температуре, растворитель упаривают, к остатку добавляют 15 мл диэтилового эфира, растирают и отфильтровывают, Вещество на фильтре промывают 10 мл эфира и высушивают на воздухе. Полученное вещество растворяют в 20 мл 1%. раствора бикарбоната натрия, фильтруют фил ьтрат подкисл пот 5% раствором бисульфата калия до рН 3. Отфильтровывают выпавшее в осадок вещество, промывают осадок ча фильтре водой и высушивают в эксикаторе над фосфорным ангидридом и гидроокисью калия. Получают: 0,318 г (94%) Е „-,, 0,32 (рН 1,9) Ен,-s0,32 (pH 5,0). К10,83. Р) - 32,9 (с 1,1 диметилформ амид) . Найдено,%: С 57,32; Н 6,38; И 12,43; , И„О„Н,О Вычислено,%: С 57,88; Н 6,43; (12,77. Йинатриевая соль .сукцинил-саркозил-трип т офйлле йцил-аспартил-фенилаланил45 -амида. Растворяют 0,255 г Suc-Sat.-Тгрьео-Аср-р еиН и 0,057 г бикарбоната натрия в 5 мл воды, раствор фильтруют и фильтрат промывают 5 мл воды. Обьединенные фильтраты лиофилизируют, получен50 ный продукт высушивают в эксикаторе. Получают 0,3 r (слегка превышает теоретический).Е (3 = 34,3 С (с l,ÎH Î). Найдено,%: С 50,03; Н 6,11; /V11,О7. С Н4 5 +7010 ФП 5Н О; Вычислено,%: С 50,28; Н 6,27; N 11,09. 93 1 10 Опыты по определению биологической > активности проводили по известным м»тодикам, Биологическую активность сукцинил саркозил-триптофил-лейцил-аспартил-феннлаланиламид и его динатриевой соли оценивали по способности соединений влиять на киспотообразоватепьную функцию желудка. Показателями жепуцочнгй секреции спужипи количество и общая кислотность желудочного сока, выделившегося из фистулы Басова, вставленной оператив-. ным путем в желудок до опыта. Данные вещества вводили ненаркозированным кошкам с желудочными фистулами парентерально. Активность соединений определяли по четырехточечному методу в процентах по отношению к стандарту. ,В качестве стандартного препарата использовали синтезированный в лаборатории пептидов ИОС AH Латв. CCP с-терминальный пентидамид гастрина трет-бутилоксикарбонил-Р алании-триптофил-метионил-аспартил-фенилананинамид (препарат пеигастрин), который предварительно был стандартизован по отношению к биологическому стандарту Human gaskr n I неьвагсй Ыапдои3 68/439,Э1ч1Моп о Bio Со г1са 6 бЬяп dard,Nai. Jnst. fey Вед. Яеэес гсп, Епц бтра.. Опыты проводили в августе, сентябре. В каждом опыте использовали две дозы (большую и маленькую) стандарта и две дозы (большую и маленькую) излучаемого соединения. Желудочный сок собирали каждые 15 мин в течение 1 час йосле подкожного введения препарата. В каждой пробе измеряли выделенное количество сока в миллилитрах. После определения количества соляной кислоты в аликвотной части пробы вычисляли общее количество соляной кислоты и пробе в миллиэквивалентах. Выделенное количество соляной кислоты в миллиэквивалентах в течение 1 час под влиянием изучаемого препарата сравнивали с соответствующим показателем, полученным на данной кошке в тех же условиях при введении стандарта. Влияние динатриевой соли 5 uc - Ь сл н Т„р.LeU Цур ЩеЯ Н на кислотообразовательную функцию желудка кошки определяется следуюшим образом. Активность соединения определяли по формуле кс активность % = Р 1 > 624911 12 где kc — доза стандартного препарата) и — доза исследуемого препарата; Р— определяется согласно формуле 2 q z 1 где Т4 — срдй оет на мжую дозу исследуемого препарата; Т - средний ответ на большую дозу исследуемого препарата; Соотношения доза-эффект (на одной кошке), полученные при введении стандартного и исследуемого препаратов, приведены в табл. 2. Таблица 2 8 5 Г 10 20 2,04 0,58 2,29 о,ве. 2,29-Я,О4- 1,% 2,29-О,58+2О4- 1,38 25 Формула изобретения М -ацилированный пентапептидамид обшей формулы: Сукцинил-саркозил-триптофил-лейцил-аспартил-фенилаланиламид или его динатриевая соль, обладающие способностью природного гастрина стимулировать выделение желудочного сока. P=1,10 активность,% = 1,10 100 = 55% Источники информации, принятые во внимание при экспертизе: 1.МогСе X.t-. "81госЫге - Xunction l-eeationships in аз.Ьг1п — Kite рер1й3еь ", Расс. Row. 8ос. В., 4967, 170,97, 40 Z.Rosehg l"en Я.,SvenSSon S E,Crotstt!in denivc4t,ives tnvestigated ог secvetot- potencv and аг chotnges in gG! э t г1с nl Qсо so 6 flic o ï1ïe f оl 1па11оп) ,Бг4 I . $. Peal-m. 1970, 58,473 средняя активность 61% 3. Авторское свидетельство СССР/. № 368243 кл. С 07 С 103/52, 14. 11.72. 4. Авторское евидетельство СССР l4 487884, кл. С 07 d 31/40, 1975. средняя активность 67% БНИИПЦ Заказ 5338/23 Тираж 559 Подписное Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Нри расчете активности основного вещества в образце получают: ,gag ploy На основании полученных даьп.ых вычислены средние величины биологической активности исследуемого соединении в проиентах по отношению к стандартному препарату: Динатриевая соль сукцинил-саркозилтриптозил-лейцил-аспартил-фенилаланинамида кошка № 1 500//О кошка № 2 74% кошка № 3 57% Саркозил:триптофил-лейцил-аспартил; .фенил-аланинамид кошка №. 1 74% кошка № 2 61о кошка № 3 66%0 средний ответ на малую дозу стандартного препарата; средний ответ на большую дозу стандартного препарата отношение между большими и малыми дозами препарата.