Способ приготовления объектов для их исследования в электронном микроскопе

° ° ° ° - a it aaa а: лиотека ЬБА (11)763733

Союз Советских

Социалистических

Республик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. саид-ву (22) Заявлеио25. 07. 77 (21) 2512977/25-2б с присоединением заявки ¹â€” (23) Приоритет

Опубликовано15.09.80. Бюллетень № 34

Дата опубликования описания 18. 09. 80 (51)м. к .з

G О! N 1/28

Государственный комитет

СССР по делам изобретений и открытий (53) УДК 54 3. 05 3 (088.8) (72) Авторы изобретения

Я. 0. Комисарчик и Е. В. Королев

Институт цитологии AH СССР (71) Заявитель (54)СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ОБЪЕКТОВ ДЛЯ ИХ ИССЛЕДОВАНИЯ

В ЭЛЕКТРОННОМ МИКРОСКОПЕ

Изобретение относится к области электронномикроскопических исследований и может быть использовано при

aèàëèçå структуры клеток, выделенных клеточных органелл, клеточных мембран, жидких кристаллов и органических макромолекул.

Известен способ приготовления срезов, применяемый в электронной f(7микроскопии, включающий дегидратацию путем последовательного замещения воды на этиловый спирт или ацетон в фиксированных денатурирующими агентами объектах, пропитку в заливочной среде,полимеризацию и ультратонкую резку, связанный с изменением ультраструктуры объекта в процессе замены воды на этиловый спирт(11 ., 20

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту к предложенному является способ приготовления объектов для их исследования в электронном микроскопе, включающий 25 быстрое замораживание до температуры жидкого азота, возгонку воды в охлажденной вакуумной камере, пропитку в заливочной среде, полимеризацию и резку на ультрамикротоме $2) 30

Недостатком этих способов является невозможность выявления неизменных структурных элементов, невозможность улучшения пропитки объекта, фиксации лиофилизированного объекта и улучшения качества микроскопического изображения.

Цель изобретения — устранение указанных недостатков.

Это достигается тем, что перед пропиткой .В заливочной среде объект помещают в низкомолекулярную гидрофобную среду с последующим постепенным замещением ее заливочной средой, причем в качестве низкомолекулярной среды применяют раствор четырехокиси осмия в низкомолекулярной гидрофобной среде.

Применение быстрого замораживания с последующей лиофилизацией при низкой температуре позволяет сохранить ультраструктуру объекта, так как при используемых скоростях замораживания не образуются кристаллы воды, нарушающие ультраструктуру, а сублимация витрифицированной воды при низких температурах позволяет избежать рекристаллизации.

Выдержка лиофилизированного объекта в низкомолекулярной гидрофобной

763733

Формула изобретения

Составитель Л. Горяйнова

Редактор Ф. Серебрянский Техред. Ж.Кастелевич Корректор E. Папп

Заказ 627 6 Тираж 1019 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, r. Ужгород, ул. Проектная,4 среде, смешанной с высокомолекулярной заливочной средой, с постепенным пслным замещением первой на последнюю приводит к качественной пропитке объекта, что дает возможность после полимеризации выявитъ на срезах структурные элементы объекта в неизменном виде. Кроме того, применение раствора четырехокиси осмия в низкомолекулярной гидрофобной среде приводит к фиксации объекта и улучшению качества электронномикроскопического изображения.

Пример. Приготовление срезов.

Быстро изолированный иэ организма исследуемый объект погружался во фреон-12, охлажденный жидким азотом.

Иэ фреона объект переносился в жидкий азот, где хранился до его помещения в охлажденную до заданной температуры камеру вакуумной установки. Далее производилась сублимация витрифицированной воды иэ объекта. После полной возгонки воды, извлеченной из вакуумной камеры, объект быстро погружался в четыреххлористый углерод. При необходимости фиксации объекта в четыреххлористом углероде растворялась четырехокись осмия. После отмывки от несвязанной четырехокиси осмия четыреххлористым углеродом объект переносился в смесь четыреххлористого углерода с заливочной средой(аралдит), концентрация которой постепенно повышалась до 100%. Далее осуществлялась полимериэация при температуре о

60 С, резка на ультрамикротоме

КВ-8800 и просмотр в электронном микроскопе EN-7. Температура жидкого фреона составляла -158 C. Рабочий вакуум камеры для высушивания объекта был 10 — 10 6мм рт.ст. Температура камеры составляла от - 20 до -40 С.

Концентрация четырехокиси осмия в четыреххлористом Углероде 20%. Объект переносился в заливочную среду из четыреххлористого углерода по следующей схеме: 6 частей четыреххлористого углерода на 1 часть заливочной среды, т.е..6:1, затем 4:1, 2:1, 1:3, 1:6, чистая заливочная среда. В каждой смеси объект выдерживался в течение 2 ч.

Использование предлагаемого способа позволяет сохранить основные компоненты в неизменном виде, улучшить пропитку лиофилиэированного материала,что создает условия для его нормальной ультратонкой резки при изготовлении объектов для исследования в электронном микроскопе, а также при. структурных анализах клеток, выделенных клеточных органелл, исследуемых мембран, жидких кристаллов и органических макромолекул.

1. Способ приготовления объектов для их исследования в электронном микроскопе, включающий быстрое замораживание до температуры жидкого азота, возгонку витрифицированной воды в охлажденной вакуумной камере, пропитку в заливочной среде, полимеризаг цию и резку на ультрамикротоме, о т л и ч а ю шийся тем, что, с целью выявления неизменных структурных элементов и улучшения пропитки объекта, перед пропиткой в заливочной среде его помещают в низкомолекулярную гидрофобную среду с последующим постепенным замещением ее заливочной средой.

2. Способ по и. 1, о т л и ч а ю шийся тем, что, с целью фиксации лиофилизированного объекта и улучшения качества микроскопического иэображения, в качестве низкомолекулярной среды применяют раствор четырехокиси осмия в ннзкотемпературной гидрофобной среде.

Источники информации, принятые Но внимание IlpH экспертизе

1. Sjosbrand F. S. Electron

Mi croscoðö of С 1 l s and T i ssues, 45

voI.1,N V,London, 1967, р. 188-219.

2. Brown and Bertke, Textbook of

Cytology, The С.V. Mosby Company, 1969, р. 15-19,