Способ получения левулозы из крахмала

 

i . Те14т1с технииесная ! --.

o n N C A H M=KСоюз Советскик

Социалистических

Республик

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К ПАТЕНТУ. (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 200375 (21) 2117153/28-1з (23) Приоритет - (32) (51) M. Кл.

С 13 К 11/00

Государственный комитет

СССР но делам изобретений и открытий

Опубликовано 250979. Бюллетень № 35

Дата опубликования описания 280979 (53) УЙК 664.162. .065.79 (088.8) (72) Авторы

Иностранцы

ИЗОбрЕтЕНИя Рональд Эмил Хебеда, Гарри Вудс Лич (ClrJA) и Руаль Гийом Филип {Бельгия) Иностранная фирма СПС Интернэшнл Инк (ClaA) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛЕВУЛОЗЫ ИЗ КРАХМАЛА

Изобретение относится к крахмало паточной промышленности, а именно к производству левулозы иэ крахмала.

Ближайшим по техническому решению к предложенному является способ полу- 5 чения левулозы из крахмала, предусматривающий приготовление водной суспензии крахмала, желатиннзацию суспензия, введение комплекса ферментов, состоящего из c(-амилазы, и глю- 10 коамилазы и иэомеразы глюкозы и гьщролиз при РН 5-7 и 40-70 С до образованию растворимого гидролизата, со-; держащего левулозу ill .

Цель изобретения — повышения эффек- 18 тивности процесса и выхода целевого продукта.

Для этого в предложенном способе комплекс ферментов вводят непосредственно в водную суспензию нежелати- ® низированного крахмала и температуру реакции поддерживают в процессе гидролиэа ниже температуры желатиниэации исходного крахмала.

Концентрация крахмала в водной суспензйи должна быть от 10 до 70 вес.Ъ!

Следует использовать бактериальную амилазу в количестве 1,0-25 единиц активности на 1 r сухого ферм нта, 2 ,глюкоамилазу - 0,1-5,0 единиц .активности на 1 r сухого крахмала и, изоме« разу - 0,1-20 единиц активности на

1 r сухого крахмала.

Предложенный способ заключается в следующем.

В качестве исходного сырья используют любой крахмал включая кукурузный крахмал иэ восковидного маиса, тапиоки, картофеля, пшеницы, сорго и т.ц. Пригодны восковидные и невосковидные крахмалы. Можно использовать также кукурузные початки и цругое сырье с большим содержанием крахмала.

Готовят водную суспенэию крахмала с содержанием последнего 1070 вес.3. Исходный крахмал должен быть в гранулированном виде, т.е ° нежелатинизированным.

Суспензия для гидролиэа должна содержать ионы магния и кобальта.

Их можно вводить в виде гексагидрата сульфата магния (MQO< 6Н О) и гептагидрата хлористого кобальта (СоСВ 7НаО) . Количество этих солей или других водорастворимых магниевых или кобальтовых солей должно составлять от 0,005 до 0,10 молей магния на 1 л и от 0,0001 до около

688138

9,124

Протеин,%

2l,2 (сухое вещество) Зольность, Ъ

64,4 (сухое вещество) Кальций,Ъ

4,9 (сухое вещество) K другим пригодным cx --амилаэам

30 относятся Термамил 60 (жидкость) и

Термамил 120 (твердое вещество) .

Ниже приведен их анализ °

98,8

Ак явность

K-амилаэы, 40 ед/г

Протеин,Ъ (сухое вещество)

Зольность, 45 Ъ (сухое вещество)

Каль ций, Ъ (сухое вещество)

Натрий, Ъ (сухое ,вещество) 1156

2105

26,5

21,2

91,2

60,1

0,04

0,72

12,2

12,3

Количество используемой бактериальной d-амилазы составляет от около

55 1,0 до около 25 единиц на 1 г крахмала (на сухое вещество) . Применение больших количеств не дает практической выгоды1 увеличенная солюбилизация крахмала при использовании более

25 единиц на 1 г не .оправдывает до60 полнительной стоимости энзима.

Q-Амилазную активность энзима определяют следующим образом. Энзиму дают реагировать со стандартным раствором крахмала при регулируемых усбф ловиях . Активность энзима определяют

0,005 молей кобальта на 1 л, в виде ионов, Эти ионы в таких концентрациях обеспечивают активность иэомеразы и не оказывают отрицательного действия на активность других энзимов.

Хотя известно, что ионы кальция облегчают действие сС-амилаэы, нет необходимости добавлять их в конверсионную смесь, а в некоторых случаях лучше их вообще не добавлять, так как, возможно, они оказывают отрицательное действие на активность изомеразы, и соответственно на конечный выход левулозы.

Устанавливают рН исходной суспензии равным от 5,0 до 7,0, t5

Выбор рН зависит от типа применяемого в способе энзима. Идеально разжижающие, осахаривающие и изоме.ризующие знзимы должны показывать свою оптимальную активность при од- 20 ном и том же рН, но практически этого не происходит. Глюкоамилаза является осахаривающим энзимом и его on am aa активность достигается при рН в диапазоне 3,5-5,0. Оптималь- 25 ная активность для K -амилазы находится при рН в диапазоне 5,57,0 и она недостаточна для облегчения нужной солюбилизации крахмала при рН ниже 5,0. Изомеразы обычно наиболее активны при ее больших рН, например порядка 7,0-9,0. Поэтому явилось неожиданным, что все три энзима действуют совместно при одном и том же рН, как это происходит на самом деле. Соответствующим рН по изобретению является диапазон рН от 5,0 до 7,0.

Температура реакционной смеси должна составлять 40-70 С ° Обычно температуру держат на верхнем пределе указанного интервала, потому ч о она должна быть ниже температуры желатинизации крахмала. Этот способ дает возможн ть избежать высокой температуры, что позволяет экономить на подаче тепла и сводить к минимуму образование окрашенных веществ и, следовательно, экономить на последующей очистке, В водную суспенэию крахмала непосредственно вводят комплекс. ферментов, состоящий из с -амилазы, глюкоамилазы и изомераэы монозы.

Предпочтительно использовать бактериальную с -амилазу, которая сохраняет активность при сравнительно низком значении рН, т.е. в диапазоне 5,0-7,0, а также при сравнительно низкой температуре, т.е. ниже температуры желатинизации крахмала. К лучшим источникам такой с6-амилазы относятся некоторые виды микроорга-. ,низма;, Baci Eius . например Вис1Иоэ subt1Eis, В. Bicbeniform1s, В.coapufans и В аачВо >gufOciens.0ooáåíío хорошими являются а -амилазы, полученные из В Bcben fovrn1s штамм Р С 1 В 8061. К другим специфичным микроорганизмам относятся В.Р(сйею огп 1 штаммы. NClB 8059, ATCC

6598, ATCC 6634, ATCC 8480, ATCC

9945А и ATCC 11945, Один такой г - -амилазный препарат имеет торговое наименование Термамил, фирмы

Ново Терапевтик Лабореториум, Копенга ген,,Дания. Термамил термически стоек, имеет широкий диапазон действия при разных рН, а) его активность и термостойкость не зависят от наличия ионов кальция.

Ниже приведен анализ этого препарата.

Сухое вещество,Ъ 94,6

Активность Ы-амилазы, ед/г

Термамил 60 Термамил 120

688138

15

S — В

2 х Е

30

45 по степени гидролиза крахмала, определяемой по уменьшению окрашивания иодом и измеряемой спектрофотомет. Рически. Единицей активности бактериальной сс-амилаэы является количестно энзима, требующееся для гидролиза 10 мг крахмала в 1 мин при условиях опыта. Этот метод применим к бактериальной -амилазе, включая промышленные препараты, кроме веществ, обладающих значительной осахаривающей способностью.

0,3-0,5 r твердого образца или . 2, 0-1, О мл жидкого образца Растворяютт в до = та т оч ном к олич ес та е

0,0025 М водного раствора хлористого кальция и получа " энэимный раствор, содержащий i! oao 0,25 единиц активности на 1 мл.

Смесь 10 мл 1%-ного раствора крахмала Линтнера, уравновешенная до о

60 С, и 1 мл образца знзима, подлежащего испытанию, смешивают и держат при постоянной температуре 60 С в ванне в течение 10 мин. Отбирают пробу в 1 мл и добавляют к смеси 1 мл

1 М водного раствора соляной кислоты и около 50 мл дистиллированной воды.

Способность к окрашиванию иодом такого подкисленного образца определяют затем добавлением 3,0 мл

0,05 %-ного водного раствора иода, разбавлением до 100 мл дистиллированной водой. Смесь хорошо перемешивают.

Спектр поглощения Раствора, по сравнению с дистиллированной водой, измеряется при 620 нм в кювете на 2 см.

Такое же измерение ведут для стандартного крахмального раствора (к которому добавлена вода вместо энэимного раствора) для создания холостого поглощения, Активность энзима в ед/г илн ед/мл равна: (холостое поглощение— поглощение пробы) — к коэффициенту

tраэбавления x50/холостое поглощениед х 10х10.

В качестве глюкоамилазы мож-! но применять известные препараты амилаэы, особенно полученные из членов рода Азрегр Ицэ, рода

EndornsceS и рода Rhizopus. Особенно хорошей глюкоамилазой является глюкоамилаза, получаемая по способу,по которому грибковый амилазный препарат .очищают от нежелательной трансглюкозидазной активности путем обработки в ,водной среде глиной. Количество применяемой глюкоамилазы колеблется от О, 1 .единицы до 5,0 на lг крахмала (сухое вещество) .Лучше, исходя из стоимости энзима и работы, применять 0,25 единицы глюкоамилазы на lг крахмала (сухое вещество) .

Единицы активности глюкоамилазы определяют следующим образом.

Субстратом является- кислый гидролизат 15-18 ДЕ кукурузного крахмаI ла в воде разбавленный до 4,0 г .сухого вещества на 1000 мл раствора.

Пипеткой отбирают точно .50 мл раствора в объемную колбу на 100 мл. В колбу добавляют 5,0 мл 1 М кислого буфера ацетат натрий — уксусная кислота (РН 4,3), Колбу помещают в о водяную ванну при 60 С и через

10 мин добавляют нужное количество энзнмного препарата. Точно через

120 мин после добавления энзимного препарата pacтвор доводят по фенолфталеину lN раствором едкого натрия.

Затем раствор охлаждают до комнатной температуры и разбавляют до полного объема.На разбавленном образце определяют величину редуцирующего сахара в пересчете на декстроэу и на контрольном образце беэ добавления энзимного препарата. Глюкоамилазную активность рассчитывают следующим образом: где A — глюкоамилазная активность в единицах на мл (или на грамм) энзимного препарата;

РЕдуцирующие сахара в пробе конвертированного энзима в граммах на 100 мл;

B — редуцирующие сахара в контрольном образце, граммы ! на 100 мл у

Š— количество использованного энэимного препарата, мл (или грамм) °

S не должно превышать 1,0 г на 100 мл.

Изомераза может быть любой, например энэим, способный конвертировать декстрозу в левулозу. Известно много иэомераз, включая, в основном, те, которые получены с помощью микроорганизмов вида Я гер1отчсеэ.

Предпочтительным видом является

Saebus 9Т-М S (АТСС Р 21132), К другим относятся S.hobifiae,s.fradiae, s.vinacens, Б.vircpniae,s.ок1чосьт отоgenes и 5.pttaeocbrornogenes

50 . Изомеразы, полученные с помощью микроорганизмов вида Arthrobacter также можно применять, например, А.nov.SP.%ЩЬ В 3724; А nov.sP.NRRL

В-37 25; A nov 5р. 5ЯЯ В-3726;

А.nov-cp.HARL В 3727 и А.nov sp.мйRL

В-3728.A также изомеразы, полученные с помощью микроорганизмов вида

lactobaciHus, напримеР 1.Brevis, L.rnannitopenS и 4.3uchneri, а также AегоbacЛег сМоасае и А.aегоgenes

60 Количество применяемой иэомеразы колеблется от 0,1 единицы до около

20 единиц на 1 г крахмала (сухое вещество) ° Обычно в предпочтительных случаях это количество составляет

65 0,2-2,0, 688138

Количество

Компонент

26,4, 29,8 .

29,3 36, 5 38,, 94

О, 1 М Мд5О4 7Н О

0,01 М СоСВ 6Н О

1 мл

1 мл

Д.Е. Фильтрата, Ъ

Декстрозы в фильтрате, Ъ

62 57,4 53,8

1М фосфатный буфер рН 7,5

05мл

1,44 г

Безводная Д-глюкоза

91, 5%

40,7%»

51,03+

5 Д.Е.

Левулоэа

Декстроэа о Зола (Ъ сульфата

d.е.) 0,35

Единицы иэомераэной активности определяются следующим образом.

Ведут спектрофотометрическое опре.деление кетонов,образующихся иэ раствора глюкозы при стандартных условиях °

Подлежащий анализу энзимный препарат ,сначала разбавляют до содержания

1-6 единиц иэомеразы в 1 мл. Затем готовят раствор:

Дистиллированная вода До общего объема 7,5 мл

Энзимную изомериэацию ведут добавлением 1 мл энэимного препарата к 3 мл раствора. Затем ведут инкубао цию его в течение 30 мин при 60 С.

В конце инкубационного периода отбирают пробу 1 мл и быстро прекращают реакцию. добавлением 9 мл 0,5 надхлорной кислоты, Затем эту пробу разбавляют до объема 250 мл. Для сравнения в качестве контрольного опыта эту процедуру повторяют,но

-вместо 1 мл энэимного препарата в виде раствора берут 1 мл воды в начале инкубационного периода.

Затем кетозу определяют методом цистеин серная кислота..

Для этого анализа иэомеразную единицу определяют как количество энэимной активности, требующееся для получения 1 микромоля левулоэы в 1 мин при описанных условиях иэомеризации.

В процессе гидролиэа крахмала температуру реакции подцерживают ниже температуры желатинизации исходного крахмала для того, чтобы сохранить крахмал в. гранулированном, нежелатиниэированном состоянии в течение всегО процесса, что приводит к увеличению выхода целевого продукта.

Непрореагировавший крахмал удаляют иэ гидролиза путем фильтрации и возвращают его в процессе.

П р,и м е р 1. К 32,7Ъ (18,4

Боме) водной суспензии гранулированного кукурузного крахмала добавляют

0,01 моля ионов магния (в виде гексагидрата сульфата магния) и 0,001 моля ионов кобальта (в виде гептагидрата хлористого кобальта), рН доводят до

5,7. Для поддержания рН на этом уровне при необходимости добавляют 1N

- водный раствор карбоната натрия. Температуру держат при 60 С и добавляют

0,07 5% (6,8 единиц активности на 1 г крахмала) аС амилазы, 0,1% (02 единиц активности на 1 r крахмала) глюкоамилаэы и 0,8% (0,33 единиц активности на 1 r крахмала) изомераэы (Gtreptornq—

ces aCbus УТ-5) . Результаты приведены

5 в таблице.

ДБ В Фильтрате, В 24

Ф

В пересчете на твердое вещество.

Растворимая фракция находится в фильтрате, полученном после фильтрования конверсионной смеси. Филь2О трация идет легко, так как в конверсионной смеси нет желатинизированного крахмала. Количество гранулированного крахмала, полученного после окончания реакции, составило 4%

25 от всего количества.

7 3% крахмала солюбилиэируются за

18 ч с выходом 29,3% (из расчета на солюбилизированный крахмал) левулеэы. По прошествии 42 ч соответ () ствующие цифры составляют 81Ъ солюбилиэированного крахмала и 36,3% левулозы. По прошествии 67 ч соответствующие цифры составляют 913 и

38,9%, д5 Пример 2. К 40,9% (23 SoMe) вс ..ой суспензии гранулированного кукурузного крахмала добавляют ионы кобаль а и ионы магния, как в примере 1. рН доводят до 5 7 и держат на

4О этом уровне во время конверсии добавлением 1И водного раствора карбоната натрия по необходимости. Температуру поддерживают 60 С и добавляют

0,15Â (13,7 единиц активности на 1 г крахмала) с -амилазы Термамил, 0,1% (0,2 единиц активности на 1 г крахмала) глюкоамилазы и 0,8В (0,33 единиц активности на 1 г крахмала) изомеразы (Stveptomsces айbus УТ-5) .

Суспенэию держат при 60 С в течение

48 ч, затем фильтруют. Ниже приведен анализ фильтрата.

ДБ 40,22%

Крахмальная проба отрицательная

65 в пересчете на твердое вещество.

688138

Составитель Г,Лошкарева

Редактор Т.Иванова Техред Л.Алферова Корректор Е.ЛУкач

Заказ 5561/56 Тираж 408 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, ж-35, Раушская наб.,д.4/5.Филиал ППП Патент, г.ужгород, ул.Проектная,4

Свыше 98% крахмала солюбилизируются в течение 48 ч и 40,7% этого солюбилизированного крахмала превращается в левулозу.

Пример 3. Готовят 25 вес.% водную суспензию гранулированного кукурузного крахмала, которая содержит следующие ингредиенты: 125 r кукурузного крахмала; 250 мл 1,0 N водного фосфатно-калиевого буфера, рН 7,5, 5 мп 1,0 N раствора гекса,гидрата сульфата магния, 5 мл 0,1 N раствора гептагидрата хлорида кобальта и достаточное количество водного хлорида кальция;

d,-амилазу (Вс: R(!us МспеяЮьгМэ ), 5 единиц активность на 1 r крахмала (сухое вещество), глккоамилаэы 1 единица активности на 1 r крахмала (сухое вещество); изомеразу (ЫгерМ@aces obvocbromogenesj 10 единиц активности на 1 r крахмала в пересчете на сухое вещество.

Эту водную суспенэию держат при

60 С в течение 24 ч рН доводят до

6,0 и по необходимости поддерживают на этом уровне добавлением водного раствора едкого калия. Конверсионную смесь фильтруют, фильтрат доводят до рН 4,5 добавлением соляной кислоты, затем кипятят для де- зактивации энзимов. В твердом веществе содержится 44,9% исходного гранулированного крахмала, что означает, что 55,1% гранулированного крахмала солюбилизировалось. В солюбилиэированном крахмальном продукте содержится 51,2% декстрозы и 20,6% левулозы в пересчете íà íà твердое веществ о.

Формула изобретения

1, Способ получения левулозы иэ крахмала, предусматривающий приготовление водной суспензии крахмала, введение комплекса ферментов, состоящего из GE -амилазы, глюкоамилазы и иэомеразы глюкозы при рН 5-7 и

40-70 С и гидролиэ до образования растворимого гидролизата, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения эффективности процесса и выхода целевого продукта, комплекс ферментов вводят непосредственно в водную суспенэию нежелатизированного крахмала и температуру реакции поддерживают в процессе гидролиза ниже температуры желатинизации исходного крахмала.

2. Способ по п.1, о т л и ч а юшийся тем, что концентрация крахмала в суспенэии составляет от

10 до 70 вес.%;

3, Способ по п.1, о т л и ч а ю25 шийся тем, что используют бактериальную амилазу в количестве

1,0-25 единиц активности на 1 r сухого крахмала, глюкоамилаэу в количестве 0,1-5,0 единиц активности

QQ на 1 r сухого крахмала и изомеразу

0,1-20 единиц активности на 1 г сухого крахмала.

Источники информации, принятые

" во внимание при экспертизе у . 1. Патент Франции Р 2215467, кле С 13 К 1/06,опублик.1974,прототип.