Способ количественного определения сульфгидрильных групп цистеина шерсти

 

Союз Советских

Социалистических

Республик

О П И С А Н И Е (»)679853

ИЗОБРЕТЕН Ия

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (6l) Дополнительное к авт. саид-ву— (22) Заявлено 30.04.75 (21) 2131184/23-04 с присоединением заявки № (51) М. Кл.

G 01 М 21/24

Гасударственный квинтет

СССР ее делам нэабрвтвннй

II вткрытнй (23) Приоритет

Опубликовано 15.08.79. Бюллетень № 30 (53) УДК 543.432 (088.8) Дата опубликования описания 19.08.79

В. В. Калинин и А. А. Мглинец (72) Авторы изобретения

Всесоюзный ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский институт животноводства (71) Заявитель (54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ

СУЛЬФГИДРИЛЬНЬИ ГРУПП ЦИСТЕИНА ШЕРСТИ

Изобретение относится к области аналитической химии, а именно к определению сульфгидрильных групп цистеина и может быть использовано в сельском хозяйстве.

Известно определение содержания сульфгидрильных групп, заключающееся в обработке шерсти 1- (4 -хлормеркурифенилаэо)-нафтолоном-2 с последующим калориметрическим измерением уменьшения реагента в шерсти (1).

Недостатком способа является его длитель- 10 ность 14-25 дней, а также сложность подготовки формамндного цветного реактива, в котором растворяют реактив Беннета: перегонка при

550С и давлении 0,1 мм рт.ст.

Кроме того, проведение анализа без гидроли- 15 за шерсти может сопровождаться неточными определениями вследствие адсорбции реагента в шерстяном волокне, а также в результате таких неспецифических реакций, как, например, образование комплексных соединений с дисульфид- 20 ными группами цистеина. Помимо этого, определение так нгэь(ваемых "замаскированных" сульфгидрильных групп возможно только при распаде водородных мостиков н гпдрофобпь(х связей в кератине шерсти.

Наиболее близким к описываемому иэобрете. нию по технической сущности и достигаемому результату является способ количественного определения сульфгидрильных групп цистепна путем последовательной обработки анализируемой пробы серной кислотой, раствором 5,5-дитиобис-(2-нитробензойной кислоты) в присутствии буфера — соляной кислоты и трис-(оксиметил)-аминометана — с последуюшим фотоколориметрированием получс пюго прн этом окрашенного раствора 12).

Недостатком известного способа является не. точное определение сульфгидрильных грпт, поскольку трис-(оксиметил}-ампнометгн в необходимой для проведения определения ЗМ концентрации приобретает желтоватый оттенок, что завышает конечный замер. Поэтому требуется дополнительная операция по сопоставлению его с бесцветным стандартом. Кроме того, трис- (оксиметил)-аминометан — основной компонент буферной системы — является дорогостоящим.

679853

Таблица 1

20 Содержание SH-гр (стандарт цистеина

10- М

Определение зкстинкции

0,095

0,173

0,242

0,320

0,390

0,470

0,540

0,610

0,680

0,725

0,100

0,180

0,275

0,360

0,430

0,520

0,580

0,660

0,740

0,820

2

4

6

8

10

Таблица 2

Содержание

SH-групп мм/г шерсти

Показатель калибровочного графика

Обра- Проба эец с

Экстинкция на

ФЭК 56-М

Навеск шерсти

0,272

0,270

0,280

0,268

0,643

0,642

13,10

13,00

19,10

19,10

31,78

31,78

Основная 0,5184

Параллельная 0,5177

Основная 0,3662

Параллельная 0,3510

Основная 0,5058

Параллельная 0,5035

0,282

0,280

0,230

0,218

0,453

0,452

11елью изобретения является повышение точности и упрощение определения. Поставленная . цель достигается описываемым способом количественного определения цистеина шерсти путем, последовательной обработки анализируемой пробы серно1г кислотой, раствором 5,5.дитио-бис-(2-нитробензойной кислоты) в присутствии бу. фера — смеси зтилендиамина хлористоводородного, аммиака и соляной кислоты, взятых в мольном соотношении от 1,2:6,1:1 до 1,3:7,3:6, Отличительным признаком способа является ! использование в качестве буфера смеси этилендиамина хлористоводородного, аммиака и соляной кислоты, взятых в мольном соотношении от 1,2. 6,1:1 до 1,3:7,3:6.

Навеску обезжиренной шерсти помещают в мерную колбу на 25 мл, добавляют 15 мл 15%ной (по объему) серной кислоты и помещают в сушильный;шкаф для гидролиза на 2,9 ч при температуре 105ОС. После окончания гидролиза перемешивают, охлаждают, доводят до метки

15%-ной серной кислотой, приливают 0,8 мл

5,5-дитио-бис-(2-нитробензойной кислоты) и

5,5 мл буферного раствора, содержащего этилендиамин хлористоводороцный, аммиак и соляную кислоту в мольном соотношении 1,2:7:3. Реакция происходит мгновенно. Колориметрирование проводят на ФЭК 56-М с синим светофильтром

М 4. Расчет проводят по формуле

А 25 ! где С вЂ” содержание SH-групп цистеина, ммоль/г;

А — показание калибровочного графика, ммоль;

25 — объем мерной колбы, мл;

Н вЂ” навеска сухой шерсти с учетом влажности, r.

В табл. 3 приведены результаты определения концентрации цистеина при различных соотноше

Построение калибровочного графика. В lO мер. ных колб объемом 25 мл приливают растворы, содержащие сульфпщрильные группы $Н цистеина шерсти, 0,1; 0,2; 0,3 ммоль/мл и так далее с последующим добавлением 5,5 дитио-бис° (2-нитробензойной кислоты) и буферной сме. си этилендиамина хлористоводородного, аммиака и соляной кислоты и проводят фотоколориметрирование полученных окрашенных растворов.

Точность и чувствительность предлагаемого метода контролируется калибровочным графиком по стандартному раствору цистеина при разных к и. центрациях SH-групп в растворе, что обеспечивает преимущество по точности определения.

В табл. 1 приведены результаты определения экстинкции настоящим и известным способом. звестным . предлагаемым пособом способом

В табл. 2 приведены результаты количественного определения SH-групп цистеина шерсти. киях этилецдиамина хлористоводородя. го, ам миака и соляной кислоты, 679853

Таблица 3

Заданная кон Ih nò. пределенная концентрация цистеина, ммоль, при мольном соотношении водного раствора аммиака, этилендиамина хлористоводородного и соляной кислоты

Формула изобретения рация цистеина, ммоль

6,1:1,2: i 7;0:1,23,4 7,3:1,3; 6

0,112

0,200

0,280

0,355

0 450

0,115

0,200

0,282

0,380

0,452

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,110

0,190

0,275

0,370

0,450

Составитель Л. Соломенцева

Редактор В. Мннасбекова Техред M.KeäeMeù Корректор А. Гриценко

Тираж 1090 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 4780/38

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Нас1ояший способ не требует применения сложного лорогостсящего оборудования, дефицитных и дорогих реактивов. К его достоинствам относятся также: быстрая растворимость всех реагентов, бесцветность буферных растворов, позволяющая проводить колориметрирование против дистиллированной воды, не прибегая к холостой пробе, освобождение от трудоемкой и ллитсльной операции по перекристаллизации реактива Эллмана. Использование аммиачной бу6 ферной системы снижает затраты средств íà определение сульфгидрильных групп в 15 раз.

Способ количественного определения сульфгидрильных групп цистеина шерсти путем последовательной обработки анализируемой пробы сер.

to ной кислотой, раствором 5,5-дитио-бис- (2-нитробензойной кислоты) в присутствии буфера, вклю. чающего соляную кислоту, с последующим фотоколориметрированием полученного при этом окрашенного соединения, отличающийся тем, t5 по, с целью повышения точности и упрощения определения, в качестве буфера используют смесь этилендиамина хлорнстоводородного, аммиака и соляной кислоты, взятых.в мольном соотношении от 1,2:6,1:1 до 1,3:7,3:6.

20 Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1, Burley B. W. "Тех. Res. J.", 1956,26, р, 332336.

2. Meichelbeck Н.etal. Die Erprobung elner

neuen Methode zur Cysteinbestimmug in Wollhudrolysaten. — "Z. ges Textilind. 1962, 70P 4, 242.