Штамм sтарнуlососсus sарrорнутiсusн 1-продуцент уреазы

 

1 и" A н й

О П С Е

ИЗОБРЕТЕНИЯ

IIII6 75986. Союз Советских

Социалистичмних

Реснублик

К АВТЬРСКЬМУ СВИ ИТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. саид-ву (22) Заявлено 211177 (21) 2545185/28-13 (я)м. к„.з с присоединением заявки ¹ (23) Приоритет

С 12 К 15/00

С 12 0 13/10

Государствеииый комитет

СССР

fIo делам изобретеиий и открытий

Опубликовано 07.1181.Бюллетень №41

Дата опубликования описания 0711.81 (53) УДК 577.15. 07 (088.8) Д.-С.Ю.Юодвальките, И.Ю.Гальвидис, Ю.Ф.Василяускас, А.А.Янулайтис и А.-С.A.Глемжа (72) Авторы изобретения

Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной энзимологии (71) Заявитель (54) ШРАММ STAPHYLOCOCCUS SAPROPHYTICUS 1-1

ПРОДУЦГНТ УРЕАЗЫ

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к получению нового штамма, используемого для получения фермента уреазы. В настоящее время для получения уреазы используют источники растительного происхождения, в основном сою, В качестве продуцентов уреазы описаны также микроорганйзмы Ргоteus

morgan1i и др;- .(1J .

Однако указанные микроорганизмы применяют только в лабораторных усЛовиях для научных целей.

Наиболее близким по технической сущности к заявленному является продуцент уреазы Вас111иь pasteurii, который используется на производстве для получения коммерческого препарата фермента, достатком укаэанного штамма является сравнительно продолжительный цикл его развития (28 ч).

Кроме того, штамм Васillus pasteu rii выращивают на среде, состоящей из дорогостоящих компонентов: полипептона и дрожжевого экстракта, что отражается на стоимости полученного продукта. Биосинтез уреазы, наконец, происходит только в присутствии субстрата, что вызывает необходимость вносить его в процессе выращивания, тем самым усложняя технологию процесса культивирования.

Цель изобретения — поиск нового штамма — продуцента уреазы, отвечающего всем требованиям производства фермента уреазы при глубинном культивировании.

В результате поиска штаммов продуцентов уреазы ий воздуха цеха мочевых пузырей Вильнюсского мясо- комбината был выделен высокоактивный штамм Staphylococcus saprophyticus

L-1, продуцирующий уреазу.

15 i1o y eHH Hot PI tuTaMM Staphylocoссus sарrophyt1сus L--1 обладает следующими морфологическими, культуральными и физиологическими признаками. Шаровидные бактерии, в стандарт20 ных жидких средах, часто образуются пары, тетраэдры, квадратные пакетики, иногда гроздья клеток. Неподви жен. Величина клеток односуточной культуры на МПА 0,5-1,5 мкм в диаметре. Клетки хорошо окрашиваются разбавленным основным фуксином и метиловым синим. Грамположительные, спор не образуют.

На МПА после 24 ч инкубации в тер30 мостате при 37оC образует колонии

675986

0,5-2 мм в диаметре. После 48 ч инкубации иногда в центре колонии образует выпуклость зеленоватого оттенка. На МПА с добавлением глюкозы и мальтозы после 48-72 ч инкубации колонии приобретают розовато-оранжевую окраску. Пигмент в среду не выделяется и ее не окрашивает. В мясопентонном бульоне вначале образуется муть, которая потом осаждается на дно пробирки. Среда. становится прозрачной. На поверхности ломтиков картофеля не растет.

Оптимальная температура ростЬ 3037оС. При 15 С растет слабо. При

50 С не растет. Факультативный анаэроб. Одинаково хорошо растет в стро- го анаэробных и строго аэробных условиях. Крахмал не гидролизирует.

Молоко не пентонизирует. Желатину не разжижает. На среде с минеральным азотом не растет. Нитраты восстанавливает в нитриты. Усваивает мальтоэу, глюкозу, фруктозу, глицерин.

Сахарозу усваивает слабо. Не усваивает лактозу, арабийозу, ксилозу, сорбит, рамнозу, маннит, дульцит и инозит. Устойчив к лизоциму. Содержание ГЦ-пар в ДНК колеблется в пределах 30,5-35 мол .%. Не патогенен.

При смешанном засеве полностью подавляет рост Proteus vulgaris, Васillus ро1ymyxa, Васillus сirculans

Культура хранится в пробирках на агаризованной среде под вазелиновым маслом.

Сравнение уреазной активности

Bacillus pasteurii u Staphylococcus

saprophyticus L-1 проводили на препа. ратах уреазы грубой очистки. Актив"ность того-и другого штаммов оказа- лась одинаковой и составляла

25 ед./мг препарата.

Штамм Staphylococcus saprophyticus

L — 1 отличается коротким циклом развития. Выращивание длится 18 ч. Среда, состоящая из дорогостоящих компонентов- - : полипентона и дрожжевого экстракта, заменена средой деше вого состава. Новая среда содержйт мйнеральные соли, кукурузййй экстракт и ферментативный гидролиэат дрожжей. Биосинтез фермента происходит в отсутствии субстрата, что упрощает технологию культивирования дан- . ного шт=чма.

Пример 1. Лабораторные опытыдля получения уреазы из бактерии

Staphylococcus saprophyticus L-1.

Для поддержки и культивирования штамма Staphylococcus saprophyt!cus

L-1 глубинным способом служили две среды: 9 1 и 2. Среда 9 1 содержит, %: пентон 1, дрожжевой экстракт 0,7.

Среда 9 2 содержит, следующие компоненты, г/л: NaC1 5, КН1Р04 2, МайО

2, 5, ферментативный гидролизат дрожжей 20, кукурузный экстракт "2 мл/л, раствор микроэлементов 1 мл/л. Состав раствора микроэлементов, г/л:

Fe Cl 6M 0 3, НпС1< 4Н О 4, Ма1Мо04 ° 2Н О 1, Н ВО 4, Ca С l> 6M<0 20, Жидкую среду 9 1 разлнвали по

100 мл в качалочные колбы объемом .

750 мл и стерилизовали при 120 С

40 мин. Жидкую среду 9 2 вначале автоклавировали при 80 С 20 мин.

После охлаждения, с целью удаления осадков, образующихся из кукурузного экстракта и ферментативного гид рблизата- дрожжей, фильтровали через бумажный фильтр. Затем разливали в качалочные колбы объемом 750 мл по 100 мл питательной среди и стерилизовали вторично при 120 С в течение

15 40 мин. Агаризованную среду 9 2 стерилизовали при 120 С 40 мин без по следующей фильтрации.

Штамм Staphylococcus saprophyticus

L-1 поддерживали в пробирках со

2О скошенной агаризованной средой 9 2.

Для оживления штамм Staphylococcus

saprohyticus L-1 пересевали на агаризованную среду 9 2 в чашках Петри и инкубировали в термостате при

37 С в течейие 24 ч. Оживленную культуру засевали в качалочные колбы со средами.9 1 и 9 2 соответственно.

Выращивали на круговой качалке (200 об/мин) при 37 С в течение 4 ч.

Таким образом, подготовленную культу-. ру использовали в качестве инокулята при глубинном культивировании. Посевной материал вносили в качалочные колбы из расчета 10 бактериальных клеток на 1 мл питательной среды.

Штамм выращивали на круговой качалке (200 об/мин) при 37 С в течение 18 ч. После 4-18 ч :роста определяли уреазную активность в высушенных ацетоном клетках. Ферментативную активность определяли колориметрическим методом. Количество аммиака измеряли, используя реактив Несслера. 3а единицу уреазной активности принимали количество фермента, катализирующее освобождение 1, с моль аммиака эа 1 мин при 30 С. Выло установлено, что максимальное накопление уреазы происходило от 9 до 12 ч роста. Культивирование в течение

О боЛее длительного времени приводило к уменьшенйю уреаэной активности.

Средние данные уреазной активности приведены в табл. 1, Т а б л и ц а 1

Среда Количество Уреазная активность опытов ацетонового препарата клеток, ед/мг

4,5

4,2 б

675986

Пример 2. Полупроизвод твенные опыты для получения уреаэы, иэ бактерии Staphylococcus saprophyt1 cus L=1.

Поддерживание штамма и подготовку посевного материала производили та- -" 5 ким же способом, как было описано в примере 1, Разница состояла лишь в том, что посевной материал в колбах на качалке выращивали в течение 12 ч.

Полупроизводственные испытания проводили параллельно на двух средах У 1 и Р 2. Состав сред указан в примере 1. Ферментеры емкостью

1, 5 м, содержащие по 750 л соответ ствующей стерильной питательной среды, засевали посевным материалом из S расчета 10 бактериальных клеток на

1 мл среды. Выра,яивание проводили при аэрации 8 м /ч (200 об/мин) при

37 С в течение 18-20 ч. рН среды поддерживали в интервале 6,8-7,2, 20 используя 25%-ный раствор аммиачной воды или концентрированную фосфорную

Т а б л и ц а 2 уреазная активность ед /мг

Среда

Вес клеток г/1 л куль-, туральной среды

КОличестВО

ОПЫТОВ культураль- белка ной среды ацетонового препарата клеток

24,4-25,0

24,0-24,9

5,6 9, 7

24,2

21,3

16,6

4,5

Формула изобретения

Штамм Staphylococcus saprophyticus L-1 — продуцент уреазы, хранится В коллекции лаборатории чистых культур Всесоюзного научно-исследовательского института прикладной энэимологии под регистрационным

Р ИПЭ вЂ” 150.

Морфологические признаки.

Шаровидные бактерии, часто образуют пары, тетраэдры, квадратные пакеты, иногда гроздья клеток. Неподвижен. Величина клеток односуточной культуры на МПА 0,5-1,5 мкм в диаметре. Клетки хороШо окрашиваются разбавленным основным фухсином и метиловым синим. Грамположительные, спор не образуют.

КультуральныЕ.признаки.

На мясо-пентонном агаре после

24 ч инкубации в термостате при

37 С штамм образует колонии диаметроМ О, 5-2 мм. Колонии серовато-белые, непрозрачные, гладкие, блестящие, выпуклые с правильными краями. После

48 ч инкубации в центре колонии иног да образуется выпуклость зеленоватого оттенка. На среде с добавлением

При полупроиэводственных испытаниях иэ 1 л культуральной жидкости получено 0,99 г сухого продукта с 40 уреаэной активностью 25.ед/мг пре-. парата.

Стоимость уреаэы, выделенной из соевых бобов, производимой Олайнским биОхимическим заводом эа . 45

1000 единиц составляет 3,75 руб.

Стоимость уреазы, производимой фирмой "Колбиохем" эа 1000 единиц составляет. 2,65 руб. валютой. Стоимость уреазы, прОизВОдимОй Во ВНИИПЭ в

10 раз дешевле стоимости уреазы, производимой зарубежными фирмами, и в

25-30 раз дешевле стоимости уреаэы, получаемой из соевых бобов.

При полупроизводственных испытаниях 1 кг грубо очищенной уреазы, полученной из Staphylococcus saprophytlcus L-1, стоит 2500 руб. с рентабельностью продукции 18,3%. Стоимость 1000 единиц данной уреазы, производимой из Bacillus -pasteuril @) в Бельгии составляет 1,0 руб. Валютой. При производстве только во

ВНИИПЭ 3,5 кг бактериальной уреаэы экономия денежных затрат составила бы около 10 тыс.руб. в год. И кислоту. После 4-18 ч роста определяли уреаэную активность в высушенных охлажденных ацетоном бактериальных клетках. В конце ферментации иэ

1 л культуральной среды центрифугнрованием (14000 об/мин) собирали бактериальную массу. Собранные и взвешенные клетки разрушали механически, используя стеклянные шарики диаметром 0,1-0,4 мм. В полученном грубом экстракте измеряли уреаэную активность .и концентрацию белка по

Лоури.

В результате полупроиэводственных испытаний было установлено, что на среде 9 1 максимальное накопление фермента происходило между 9-12 ч роста, на среде 9 2 — между 9-15 ч роста. Дальнейшее культивирование не приводило к падению уреазной активности

Средние показатели ферментативной активности приведены в табл. 2.

67598$. ",. 8 ,-,е ° б глюкозы и мвлвтозы после 4В-72 ч " " — розу усваивает слабо. Не усваивает ,,..РОСта Вч тЕрМОСтатЕ ПрИ 37 С КОЛОИИИ «аитсзу, арабИИОзу, КСИЛбву, СсрбИт, приобретают розовато-оранжевую окрас- рамнозу, маннит, дульцит и иноэит. ку. Пигмент в среду не выделяется и Устойчив к лизоциму. Содержание.ее не опкрйаивает. В мясо-пейтонйом ГЦ-пар в ДНК колеблется в пределах бульоне вначале образуется "муть, ко- 30,5-35 мол.Ъ. Не патогенен. При торая затем оседает на дно пробирки. смешанном засеве полностью подавСредуа Стайовится прозрачйо«й. Йа«по- ляет рост Pro reus vul gar t s, Bacillus верхности"ломтиков"картофеляч" не poiymyxa, Bacillus circulans. растет. Культура хранится в пробирках

Физиологические признаки. о на агариэованной среде под ваэелиОптимальная температура роста 30- новым маслом.

37 С при рН 6,7-7,2. При 50ОС не Источники информации, растет. При 45 С растет срла6о. "Фа - "" йроинятысел во внимание при эксйертиэе культативный анаэроб. Одинаково хо- 1. Wong B.L., Shobe C.Р. 1974 рошо растет в строго анаэробных,и Canadian Journal of Microbiology, строго аэробных условиях. Крахмал 15 v. 20, Р 4, рр. 623-630. .не гидролиэирует. Молоко не пентони- 2. The 1975"1976 Albrich-Europe зирует. Желатину не разжижает. На -, Catalog/Hand book оФ Organic and среде с минеральным источником азо- Biochemicals.The Sourse Janssen Pharmaта не растет. Нитраты восстанавли- centiña N.Y. Aldrich-Eur oðe. Beigium.- . - вает в нитриты. Усваивает мальтозу, Я tica N Y. Аidrich-Eurоре. Ве1gium, глюкозу, фруктозу, глицерин. Саха- 1974 (прототип).

Составитель Н.Паников

Редактор Е.Месропова Техред С.Мигунова Корректор Г.Назарова

»«л «»» «« л ««л.л, :

Заказ 9177/35 Тираж 531 Подписное

ВНИИПИ ГоСударственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж- 35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Ф з», «ет» Х к..- ар: