Реактив для определения тригицеридов

 

Союз Советских

Социалистимеских

Республик

<»641884 (61) Дополнительный к патенту (22) ЗаЯвлено 30.07,76 (21) 2386217/23-04 (23) Приоритет (32) 12.08.75 (31) Р 2535953.9 (ЗЗ) ФРГ

Опубликовано 05.01.79,Бюллетень № 1

Дата опубликования описания 08.01.79 (51) М. Кл, G 01 Й 31/14 государственный квинтет

СССР ло делам нэобретеннй н открытнй (53) УДК 543.853..76(088.8) Иностранцы

Элли Раушер, Эрих Бернт, Вольфганг и Хельмут Детерманн (ФРГ) Иностранная фирма

Берингер Маннхвйм ГмбХ (ФРГ) (72) Авторы изобретения

Г убер

I, 1

1,-.

>J

«1 (71) Заявитель (54) РЕА1(ТИВ ElJIH ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТРИГЛИБЕРИДОГ

Изобретение относится к аналитической химии, в именно к определению триглицеридов, в продуктах питания, крови и сывороткее.

Известен реактив для определения трцглицеридов, содержащий липвзу из R1I11p1

pU5 аггЬ1т.04, буфер, Д. -химотрипсин, глицеринкиназу, лактатдегидрогенвзу, сы— вороточный альбумин аденозин-5-трифосфата, фосфоенолпировиноградную кислоту, восстановленный никотинамид — адениндинуклеотид, пируваткиназу (1).

Недостатками реактива являются большой расход фермента и длительность проведения анализа для определения триглицеридов.

По технической сущности и достигаемому результату к предлагаемому реактиву наиболее близок реактив для определения триглицеридов, содержащий липвзу gp из Rtl1zopU5 аггтиъав, карбоксилостервзу из микроорганизмов, додецилсульфат натрия. никотинамид — вденин— динуклеотид в восстановленной форме, 2 вденозинтрифосфат, фосфсенолпируват, лвктатдегидрогеназу, фосфоенолкинвзу, глицеринкинвзу, вльбумии сыворотки, сульфат магния, буфер и воду f2).

Недостатком этого реактива является невысокая точность определения, твк как в сильно липемических сыворотках появляется муть в результате осаждения выделяющихся в свободном виде жлрных кислот, что сильно препятствует оптическому определению.

Белью изобретения является повышение точности определения.

Бель достигается описываемым реактивом для определения триглицеридов, KGторый содержит лыпвзу из 881 20 p u s сего птго, карбоксилэстеразу из мик= рооргвнизмов, додецилсулыфвт натрия, никотинвмид — аденин-динуклеотид в восс тановленной форме, вденозинтрифосфат, фосфоенолпируват, лактатдегидрогеназу, фосфоенолкиназу, глицеринкиназу, альбумин сыворотки, сульфат магния, буфер

641884 и воду, а также дополнительно — соединение общей формулы

ЗО(СН СН а)„Н где Я вЂ” апкипьная ипи апкенильная группа С1 - С и — 7-20, при следующем соотношении компонентов, вес%:

Липаза из QtljZOpuS apt 33ZUS

0,01-1,00

0,07-1,40

0,6-6,0

О, 1-0,9

0,03-0,3

О, 1-3,0

Пример 1. Реактив согласно изобретению приготавпивают из следующих смесеи:

1) раствор буфера: 0,05 М натрийфосфатный буфер, рН 7,0, содержащий

4 ммопь сульфата магния„0,01% додеципсульфата натрия, О,015% полигпикопевогЬ

К арбоксилэс тераза из микроорганизмов 0,001-2,00

Д одецилс ульфат натрия 0,001 -0,02

Никотинамид-аденин- 15

-динуклеотид в восстановленной форме

Аден озинтриф осфат

Фосфоенолпируват

Лактатдегидрогеназа 0,05-0,5

Фосфоен опкиназа О, О 2-0 5

Гпицеринкиназа 0,005-0,5

Альбумин сыворотки 0,01-0,2

Супьфат магния с содержанием ионов магния

Буфер

Соединение

Зо общей формупы

HQ(CH р CHg О)„Н где Я- апкильная или апкенипьная группа С1,1- С

11 -7-20 0,001 5-0,03

В ода Остальное

Отпичитепьный признак предлагаем oro реактива состоит в том, что он дополнительно содержит соединение общей форму- 0 лы ЯО(СH CH O) H где T(— алкипьная ипи апкенипьная группа С 4- С с,. д — 7-20.

Применение предлагаемого реактива повышает точность определении. Кроме того, он позволяет сократить продолжительность определения до 10 мин и при этом работать при комнатной температу5( ре эфира цетилстеарилового спирта (с 12 моль окиси этилена);

2) коферментная смесь 10 ммопь ннкотинамид-аденил-динукпеотид в восста« новпенной форме (НАДН+), 22 ммопь

АТФ вЂ” СНА опи, 18 ммопь ФЭП-CHA-с: опию

3) ферментная смесь 400 ед.акт/мп пипазы (ЯЫхоро51 at гни у.о )

50 ед. акт/мп карбоксилэстеразы (из микроорганизмов) 50 ед. акт/мл фосфэенопкиназы (ФК) (из мускулов кролика), 300 ед. акт/мл лактатдегидрс геназы (ЛДГ) (из серца свиньи) в виде суспензии в растворе сульфата аммония;

4) 150 ед. акт/мл гпицеринкиназы (ГК}, суспендированной в растворе сульфата аммония, о

Смеси 1-4 могут храниться при 4 С минимально в течение одного года. Смесь

2 после растворения при этой температуре может храниться около двух недель.

Из реактивов 1-3 приготавливают смесь, которая в охпажденном виде может храниться около двух дней. Смесь 2 к тому же растворяют предварительно в дистиллированной воде. Для приготовления реакционной смеси смешивают растворы реактивов 1; 2 и суспензию реактива

3 в объемном соотношении 50:1,0:1,0.

Определение с контрольной пробой, 5, О мл смеси 1-3 смешивают с О, 1 мл сыворотки. Затем отбирают 2,0 — 2,5мп и смешивают их с 0,01 мп суспензии реактива 4 (проба); остальное спужит контрольной пробой. Растворы прсбы и контрольной пробы выдерживают около 10 мин о при 20-25 С и измеряют экстинкцию пробы по отношению к величине контрольной пробы. Найденную величину применяют для расчета.

Определение без контрольной пробы.

2,5 мп смеси 1-3 смешивают с 0,05мл сыворотки, выдерживают 10 мин при о

20-25 С и измеряют экстинкцию этого раствора. Затем прибавляют 0,01 мл суспензии 4 и через 10 мин снова изме-. ряют экстинкцию, Разницу между обоими показаниями применяют дпя расчета. Измеренчя проводит на фотометре при 365, 340 ипи 334 нм. Расчет проводят в зависимости от длины вола измерения умножением разницы экстинкций на 15,5 (365 нм) ипи 8,23 (340 нм),-или 8,53 ( (334 нм}. При этом резупьтат получают в ммопях тригпвжрида i на 1 п пробы.

641884

Найдено после оценки без контрольной пробы 477 мг триглицерида/100 мл сыворотки, Через 10 мин после оценки без контрольной пробы найдено 513 мг триглицерида /100 мл сыворотки.

С реактивом согласно изобретению пслучают практически идентичные величины при измерениях с учетом и беэ учета контрольной пробы. С известным реактивом получают различные величины (за счет появления мути), разница определений в данном примере около 8 о.

55

Повторяя определения с различными количествами триглицерида в сыворотке, получают прямую.

Пропорциональность (коэффициент корреляции) 0,997. 5

Пример 2. Для сравнения реактива согласно изобретению с известным проводят следуюшие опыты, Опыты 1 и 2, Смашивают 4,9 мл раствора 1, который состоит из 0,1 М t0 натрийфосфатного буфера, рН 7,6, содержащего 4 ммоль сульфата магния, 1,5мг альбумина, сыворотки и 0,01% додецилсульфата натрия; 0,2 мл раствора 2, состоящего иэ коферментной смеси 6 ммоль 15

НАНД, 33 ммоль аденозинтрифосфата (АТФ) и 11 моль фосфоенолпирувата (ФЕП);

0,1 мл раствора 3, который включает 2

2 мгlмл ЛДГ и 1. мг/мл ФК, в форме суспензии в растворе сульфата аммония; раствор 4, состоящий из коферментной смеси 0,2 мг липазы из RQ)mopus at IQ gyc и 4,0 мг карбоксилэстеразы;

О, 1 мл сыворотки (примерно 50 мг триглицерида). От полученного раствора отбирают 1,5 мл в кювету 1, остальное— в кювету 2, Опыты 3 и 4, Смешивают 5 мл реактива 1 по примеру 1; 0,1 мл реактива 2 по примеру 1; 0,1 мл реактива 3 по приме- З0 ру 1 и 0,1 мл сыворотки (как в опытах

1 и 2). От приготовленного раствора отбирают в кювету 3 2,5 мл, остальное— в кювету 4.

Через примерно 20 мин отбирают пи35 петкой в каждую из кювет 1 и 3 по

0,01 мл суспензии ГК. Кюветы 2 и 4 остаются для контрольной пробы.

Ниже приведены полученные результа40 ты.

Найдено после оценки с контрольной пробой 517 мг триглицерида /100 мл, сыворотки. Через 10 мин пссле оценки контрольной пробой найдено 508 мг три

45 глицерида/100 мл сыворотки, Непосредственно после прибавления пробы загрузки во всех опытах почти прозрачны. В кюветах 1 и 2 через 5мии образуется заметная муть. В кюветах 3 и 4 через 0,5 мин раствор становится прозрачным, Через 55 мин раствор в кювете 4 все еше прозрачен, а в кювете

3 очень мутен.

Пример 3. Для приготовления реактива согласно изобретению используют:

1) раствор буфера; 0,02 М фосфат натрия в качестве буфера, рН 7,0, содержащего 3 ммоль сульфата магния, 0,01 мг/мл додецилсульфата натрия, 0,01 5 мг/мл цетилстеарилалкогольполигликольэфира с 12 ммоль этиленоксида и 0,1 MF/мл альбумина плазмы;

2) смесь коэнэимов, как в примере 1;

3) смесь ферментов; 0.2 мл липазы из R93ZQpus at t И jzus, 0,2 мг/мл

ФК (из мускулов кролика),. 0,2 мгlмл карбоксилжтеразы (иэ микроорганизмов}, 0,5 мг/гл ЛДГ (из сердца, свиньи плн мускулов свиньи или кролика) в виде кристаллической с успенэии;

4) 0,05 мг/мл ГК в виде кристаллической суспензии, Смесь реактивов приготавливают по примеру 1, исследование проводят так же, как в примере 1.

При исследовании 10 сывороток человека и 3 контрольных сывороток получено хорошее совпадение результатов с результатами, полученными в примере 1, Коэффициент корреляции 0,991.

Пример 4. Для приготовления реактива согласно изобретению применяют:

1) буферный раствор — 0,1 М фосфат натрия в качестве буфера, рН 7,0, содержашего 8 ммоль сульфата магния, 0,2 мг/мл додецилсульфата натрия, 0,3 мг/мл цетилстеарилалкогольполиглнкольарира с 1 2 моль этиленоксида, 2,0 мг/мл альбумпна сыворотки;

2) смесь коферментов; 20 ммоль IAQI I, 100 ммоль АТФ, 20 ммоль ФЕП в дистиллированной воде;

3) смеси ферментов: 10 мг/MG липаэы из Rtl4ZOpUS Ot r5. Хц, 20 мг/мл карбоксилэстеразы (из микроорганизмов), 5 мг/мл ФК (иэ мускулов кролика), 5 мг/мл ЛДГ (иэ сердца свиньи или мускулов свиньи или кролика), как раствор в буфере;

4) 5 м /мл ГК, 7

643 88 3

0,001-2,00

0,001-0,02

0,07-1,40

0,6-6,0

О, 1-0,9

0,05-0,5

0,02-0, 5

0,005-0,5

О, 01-0,2

0,03-0,3

О, 1-3,0

7-20 0,0015-0,0

Ос тальн ое

ЦНИИПИ Заказ 7564/59 Тираж Agg Подписное

Филиал ППП Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Смесь реактивов приготавливают по примеру 1, исследование проводят как в примере 1.

При исследовании 10 сывороток человека и 3 контрольных cblsopoT получе- 5 но хорошее совпадение результатов с результатами примера 1. Коэффициент корреляции 0,994.

Пример 5. В одном сравнительном эксперименте вместо 0,015% цетил- 10 стеарилалкогольполигликольэфяра используют подобные вещества, Смесь реактивов приготавливают по примеру 1, эксперимент проводят, как в примере 1, 15

При использовании 0,01% олеилалкогольполигликольэфира (Я -С Н;

35 и-10) достигнуто хорошее совпадение одиночных результатов, коэффициент корреляции 0,989, 20

Аналогично применяют 0,1% миристилалкогольполигликольэфир (g- С 4 H д-12), 0,05% стеарилалкогольполигликольэфир (g- С 8 И,,; и- 20}, О, 03% цетилалкогольполигликольэфир (Ц- С1@ Н ; д-7), а также 0,01% эйк озилалк or ольп олиглик ольэфир (q-с Он„,; п-20).

При 20 пробах получены следующие коэффициенты корреляции; 0,992; 0,990;

0,997; 0,987.

Пример 6. Ст одного и того же лица взяты плазма, гепарин (около

0,75 мг гепарина на 1 мл крови) и сывортка ЕДТА (примерно 1 мг ЕДТА— этилендиаминтетраацетата двойной натриевой соли на 1 мл крови) и использованы в качестве обоазцов. Реактив готовят, так в примере 1. Б сыворотке устаноалено 576, в плазме гепарина 552 и в плазме ЕДТА 563 мг триглицеридов в

100 мл пробы, Повторяемость в отношении сыворотки составляет 96-98%. Показатели отличаются в пределах, обусловленных точностью метода.

Формула изобретении

Реактив для определения триглицеридов на водной внове, состожций из липазы из Я и оров gpp%ix,us, карбоксилэстеразы из микроорганизмов, лоленнлсульфата натрия, никотинамид — аленнндинуклеотида в восстановленной форме, аденозинтрифосфата, фосфоенолпирувата лактатдегидрогеназы, фосфоенолкиназы, глицеринкиназы, альбумина сыворотки, сульфата магния и буфера, о т л и ч а к шийся тем, что, с целью повышения точности определения, он дополнительно содержит соединение общей форЯО(СНУ СН О)„Н, где Й вЂ” алкильная или алкенильная группа С - С ., (- 7-20, при следующем соотношении компонентов, вес. %:

Липаза из Akim& pu S а г г Ь1Х U S

0,01-1,00

К арб окс ил эс те раза из микроорганизмов

Додецилс ульфат натрия

И ик отин амид-аденин-динукле отид в восстановленной форме

Аденозинтрифосфат

Фосфоенолпируват

Лактатдегидрогеназа

Фосфоенолкиназа

Глицеринкиназа

Альбумин сыворотки

Сульфат магния с с оде ржанием ион ов магния

Буфер

Соединение общей форм улы

ЙО(СН СН О)пН где %- алкильная или алкенильная группа С1 — С о, ц—

B opa

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:

1.G.Bucofo е1 de AAecbanized Enziщо 1с Берегvination о Тг1 6зсег деь

in set uò Сйщ.СИее., 1975. 21, (3) р. 424-426.

2. Патент ФРГ Л" 2229849, МКЛ 601 N 31-1.4, 1974,