Способ получения антигенов
ОП ИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
Союз Советскин
Социалистических
Респубпик
К ПАТЕНТУ (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 10,07... (21) 1 9©792/31-16 (23) ПриоРитет 10.07,72(32) 10.07.72
2 (5l) М. Кл, А 61 К 39/00
Государственный номнтет
Соавта Мнннстрав СССР па делам нзабретеннй н открытнй (31) 270273 (33) США (43) ОпУбликовано 25.11.77Бюллетень №43 (53) УДК 578.8.097 (088. 8) (45) Дата опубликования описания 20.11.77
Ин остр анец
Кнут Бертил Бьеркпунд (Швеция) (72) Автор изобретения (71) заявите пь (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНОВ
Изобретение относится к области медицины.
Известен способ получения антигенов из злокачественных образований и нормальных тканей путем обработки гомогенизированных тка>1ей органическими растворителями, лиофилизацией осадка на шаровой мельнице прн низкой температуре с последующим гилролизом гомогента раствором NBOH и центрнфугированием. Затем налосалок црогревают при 95
l00 С и осаждают при рН 4,5 белки, которые затем растворяют в буфере или воде.
Однако такой способ не обеспечивает высокой специфичности антигенов .
Для новь)ц)ения сц(цнфи (ности антнг(.нов по прелложcí((îìó способу растворенные в буфере белки фильтрук)т через гель, собирак>т фракции мол. вес. (0.106--20-l0 и повторно фильтруют через гель, собирают первую активную порцию, ловолят до рН 5,0, соединяют осалок с ) елсм мол. в (, 2.000 уравнове)ц HHb(M буфером при рН около 5,0, помещают на колонку с тем же гелем, элк>ируют растворами со сникаю)цимся градиентом рН н собирак)т фракцнк>, элк>ирусмую ill)ll l)ll 3,0.
Карин)l()Mные или нормальныс TKHHH в замо))ож(пном состоянии отдслыш> (.мсп)цвак)т с иод(>й цри T(мцсратуре около 0 (. н гомогеннзируI() I г ) к, ) г()б),1 и(создавать излив) н(го T(I(J(d трения, которое может вызвать инактивацию связанных с раком полипептидных антигенов (СРПА) . Температура суспензии не должна превышать 0 С.
Полученную холодную смесь жидких гомогснатов и твердых веществ смешивают с органическим растворителем, способным растворять липиды (например природные жиры), ацетоном или этиловым эфиром при температуре около
0 С. Цель обработки растворителем заключаш ется в удалении липоидных веществ и в увеличении времени действия антигенных групп.
Твердые вещества отделяют от смеси центрифугированием, воду и слои растворителя удаляют, Температура не должна превышать плюс 4 С.
Выделенные твердые частицы лиофилизируют и лиофилизированный тканевый порошок размалывают в шаровой мельнице при температуре минус 70 С. После размола получают тонкий серо-коричневый порошок.
Полученный порошок экстрагируют солевым раствором, верхний слой после центрифугнрования улаляют. Полученный осадок снова суспендируют в хололной воде, выделяют и лиофи)изируют. Полученный порошок можно хранить годами в закрытых бутылках при плюс 4 С.
Прн экстрагировании опухолевых я нор2; м алых цор(ников, содержащих полипептиды.
581842 водой при щелочном рН среды экстракты мутнеют после добавления ЙяС! при нейтрялнноч или слегка щелочном рН, Этя мутность возникает из-за присутствия примесей нуклеиновых кислот. После центрифугирования обработанных рассолом экстрактов вся активность остается в прозрачном верхнем слое. Верхний слой осаждают изоэлектрически при кислом рН около 4,8 и полученный осадок растворяют н водном фосфятном буферном растворе при рН около 7,0.
Полученный раствор фильтруют на соответствующем молекулярном сите гелевого типа в слое, позволяющем фрякционировать соединения по молекулярному весу н диапазоне от 10-10 до 20 10 предпочтительно 15 10 .
Фильтрующий гель элюируют буферным раствором при нейтральном рН, при этом выделяап молекулярные фракции 10 10 до 20-!О, предпочтительно 15 10 .
Выпавшую активную фракцию из гелевого фильтрования растворяют в буферном растворе рН около 7,0. Полученные растворы фильтруют через колонку, загруженную слабым ионообМеииыч молекулярным ситом типа геля со слабыми ионообменными свойствами, например полиакриламидным гелем Био-Гель Р-2, причем колонка уравновешена аналогичным буферным раствором рН около 7,0. Первая фракция, выходящая из колонки, которую выделяют, обладает антигенной активностью.
Выделенную фракцию из хроматографии на
Био-Геле Р-2 подвергают особой обработке для дальнейшей очистки СРПА. Эту обработку осуществляют следующим образом. Смесь протеинов или сопряженных протеинов осаждают изоэлектрической регулировкой рН. Полученный осадок смешивают с соответствующим гелем, подобранным, исходя из имевшейся протеиновой смеси. Полученную смесь осадка и геля загружают в верх колонки, содержащей идентичный гель такого же изоэлектрического рН, т, е. рН, который является изоэлектрическим для протеинов при осаждении их в предыдущей стадии. Затем колонку элюируют rpè постепенно возрастающем или уменьшаюгцемся рН.
В элюате выделяют те фракции, н которых содержатся нужные протеины, Нормальные и СРПА фракции., выделенные хроматографией, подвергают осаджению активного вещества, при рН около 5, осадок выделяют и растворяют в воде при рН около 8,5. Затем рН прозрачного раствора доводят до кислого рН около 5 0 при помощи муравьиной кислоты, такая обработка приводит к осаждению. Каждый осадок смешивают с шламом полиакриламидного геля, уравновешенного HCOOH—
-HCOONt- при рН около 5,0. Каждую из таких смесей помещают в верхнюю часть геленой колонки, уравновешенной как указано.
Для элюирования осадков применяют рНградиент, и в этом случае с постепенно уменьшающимся рН. Соответствующей буферной системои является НСООН НС001МН4 Р
N H Н(.0, — N H, Антигенняя активность установлена в выходящей жидкости в диапазоне рН оТ начальног0 рН до рН 3. Выделенная
ЗО
60 жидкость н этом диапазоне р11 содержи нужные СРПА, которые можно выделить вымораживанием. Лля установления молекулярного веса СРПА этой фрякпии жидкости фракцию фильтруют на геленой колонке, уравновешенной НСООН-HCOONH при рН около 3. Зятем выделяют элюированные фракции СРПА со спектрофотометрическим пиком поглощения н диапазоне 229 — 233 мкм. и мол. вес. 20.000-27.000. СР11А можно выделить после фильтрования нз активной фракции нычоряживанием, их можно хранить длительное время н вакууме, на холоде, в течноте, Выделенное вещество состоит из полипептида на основе одной полипептидной цепи. СРПА имеют основную реакцию и растворичы при рН
1--3,5, Незащищенный полипептид денатурируется необратимо при нейтральных рН, а именно при рН 4,6. Антиген гигроскопичен, переходит н желтую окраску и становится неактивным и вязким при поглощении влаги.
Очищенные СРПА содержат флуоресцируюгцую группу, эта группа активируется при длине волны около 288 мкм и излучает свет при длине волны около 350 чкм. Флуоресценция пропорциональна количеству СРПА и может быть использована для определения наличия полипептида при его выделении.
Спектрофотометрический пик поглощения
СРГ1А находится н диапазоне длин волн 229—
233 мкч. Кроме того, они склонны к агрегированию и не фильтруются ня нормальной фильтровальной среде, применяемой для стерилизации, они не содержат углеводов и, как показывает спектрофотометрия, не содержат нуклеиновых кислот.
Выделенные СРПА можно широко использовать, например при получснии моноспецифичных антител для диагностических целей, для иммунизации в качестве активного ингредиента н состанах.
Пример 1. Выделение чистого антигеня.
Карциномные и нормальные ткани из аутопсий раздельно чисто отрезают от соседних тканей и разрезают на кубики 2--3 см, эти кубики промывают н 0,9%-ноч растворе NaC1 при
0 С до тех пор, пока они не перестают выделять кровь. Промытые кубики зямораживают и хранят при минус 24 С.
В замороженном состоянии тканеные кубики смешивают с 10 мл воды при 0 С на 1 г замороженной ткани, затем их гомогенизируют в охлажденном гомогенизаторе. Температуру суспензия выдерживают при 0 С или несколько ниже.
Холодный гомогенат выливают н охлажденные полиэтиленовые бутылки !000 чл. В каждой бутылке смешивают 400 чл суспензии и
400 чл этилового эфира при минус 20 С, перемешинание недут прн минус 2" С н течение 2 час в центрифуге-трясучке (300 об(чин). Смесь центрифугируют при минус 2 С н течение
5 мин. В этой стадии липидный слой не смешивается с тканеныч слоем. Этиловый эфир н липид выбрасывают и проводят вторую экстракцию н течение 1 чяс с последующим центрнфугиронанием н течение 5 чин и удалением эфирлнпидного слоя.
1842
Для дальней)пей <)листки СPIlA осевшие активные средние фракции из пяти колонок БиГель-А-50м растворяюг в !/150 М
20 буферном растворе прн рН 7,0 (буф< р < г>пенсеня в 2О/ -ном бутанолс) до У/<> нячяг)b>>ого объема о г жидкости. Этот раствор, содержапгнн l,)0 мл протеина в 8,5 мл фильтруют через колонку с Био-Гелем Р-2. Колонку у!)явновец)ивя)<>1
1,150 M буферным раствором рН 7.0 (бу<1)ер
Соренсена в 2"/<>-ном бутяноле1. На к яждь)й миллиг рам м протеина допускают объем < . ) оя
l0 мл.
Первая фракция активна, ее отводят элюнрующим буферным раствором рН 7,0. я примеси
ЗО сорбируют на геле при низкой ионной v нл<.
Активное вещество осаждают при рН 4,8 прн помощи 0,1 М НСООН н центрифугирукл llpu
0 С в течен)<е 5 мн l. Осядо«раста<>!)ян>«<
8,5 мл Bo1bl, рН доводят до 8,5 «1ом<>>цьн>
0 М NH ОН. I!розрячный рял в )l) снова осяж да>от грн раза О,! М 1!СООI! прп р!! 4.)<, промывают в центрифуге при гаком ж» pll u растворяют прп рН 8,5. Исчезновение бутаноJlB прослеживя<от газо-жидкостной хроматографией, Готовый раствор хранят в ампулах лио4О фнлизировянным н замороженным. Полученный продукт представляет собой сухой, почти белый порошок, который хранят прп минус
24 С в эвакуированных герметичных ампулах.
Для дальнейшей очистки продукта, полученного в результате предыдушей хроматогряфи4 ческой обработки, разработан способ элюирования с градиентом рН. Этот способ заключается в следующем. Подлежащую очистке o) активного компонента протеиновую смесь осаждают изоэлектрическим регулированием рН.
50 Осадок Эту смесь наносят слоем в верх колонки, содеркащей такой же гель с таким же изоэлектрн IåñкнM рН. Зятем колонку элк>пруlor о гряди<. > Таким образом колонку элюируют средой с 55 непрерывно н ступенчато возрастающим или снижяюшим< я рН. Гряди< нтное элюнрованн» 11!)оволят с !5 мг лиофилнзнровянного и обессолен>1<)го норов)ка СРПА и нормального янтнгенного п<)ро<нкя, o n > å<>) <> иным < пособом, l) дан 1<< > и с.! .. l1!) u <.llil ih > ю и !< M <. я з н;1 ч х u ll u l>! l . I „ !) „ >11<, и 58 Затем проводяl центрифугировяние при минус 2 C в течение 30 мин, водный слой удаляк>т, хотя он содержит некоторое количество СРПА. Оставшиеся нерастворимые вещества сохраняют. Оставшийся этиловый эфир удаляют вакуумом в течение 5 мин. Антигенный материал суспендируют в 50 мл воды при 0 С, переносят в инфузионные бутылки на 500 мл и замораживают при 70 С (сухой лед в этаноле). Лиофилизацию ведут в лиофилизаторе при регулируемой температуре, Лиофилизироваиный тканевый порошок размалывают в шаровой мельнице при температуре минус 70 С в течение 2 час при 40 об/мии. После размола получают тонкий серо-коричневый порошок. Этот порогцок экстрагируют предварительно охлажденным до минус 2 С эфиром в центрифуге-трясучке при 300 об/мин в течение 1 час и центрифугируют при минус 2 С в течение 30 мин. Эфирный слой удаляют и остаток сушат в вакууме. Полученный сырой тканевый порошок (СТП1 можно хранить годами при 4 С в герметичных бутылках без заметной потери акти.)ности. Суспендируют 5 г СТП при нейтральном рН в 500 мл солевого раствора, содержащего стериальные кубики льда. Суспензию гомогенизируют, температуру выдерживают при 0 С в течение 30 мин при слабом перемешивании. Центрифугирование ведут при 0 C в течение 40 мнн. Верхний слой выбрасывают. Осадок снова суспендируют в 500 мл холодной дистиллированной воды и медленно перемешивают пр>1 0 С в течение 30 мин. После центрифугирования при 0 С в течение 40 мин верхний слой удаляют. Оставшийся осадок суспендируют в 25 мл холодной дистиллировяннои воды и замораживают при минус 70 С (сухой лед в этаноле). После лиофилизации получают промытый тканевый порошок (ПТП), который можно хранить годами в герметичных бутылках при 4 C. Приготавливают водные экстракты СРПА и нормального тканевого порошка (НТП) при рН 9,5 концентрпру<от нх 10 ряз изоэлектрическим осаждением при рН 4,8 и растворением осадка в О,! объема воды прн рН 9,5, Полученный концентрат стабилизируют быстрым нагревом до 98 — 100 С и выдержкой при этой температу.ре в течение 5 в 10 мин. Такая термообработка разрушает энзимы, которые дезактивируют СРПА. Стабилизированный экстракт мутнеет после добавления солевого раствора при рН 7.5 вследствие осаждения оставшихся примесей нуклеиновых кислот. Для осаждения оставшихся примесей отдельно осаждают 8,0 мл водных экстрактов СРПА н нормальных добавлением 0,8 мл 10 /р-ного раствора !х!яС!. После центрифугирования прн 0 С в течение 1 час прозрачные верхние слои осажда)от изоэлектрически при рН 4,8 (pH регули.>у»т 0,1 N HCl нли 0,l N HCOOH). Осадки растворяют в 2— 3 мл l, l50 М фосфатного буферного раствора р>1 7,0. П<)зученные растворы из опухолевых и норм-<льа>,)к HTIl фильтруют через Био-Гель Р. "» м 3 охлажденных колонка . Гель урявновеь l!-;;1)т !,1)0 М фосфятным бу< рным растворе рН 7,0 <. 2О/р бутанола и элк)>:,>чют этим 6 же буферным ряс)вором. В кяжд<>м оп)п< llpuменя)от 4- -8 мл эксгРактя, c<>a<.p)>,uul <;) всег<> 50--!00 мл прозвиня. Антигеннук) якгикность <>б)няруживя» т я средней фракции, выходяп<, к жидко< ти опухо«х левг>гo экстракта. Порции >1<> h<ë эт<)й фракции, всего t60--180 мл, разбявляю1 три раза и доводит до разных значений pl 1 от 2,0 ло 9,0. После 6 мин пребывания при кочня)но)< температуре пробы переносят в кюветы н определяfor 10 их светорассеяния при 500 мкм под углом 90" Зависимость интенсивности рассеивания <л рН показывает максимум при рН 4.8, это значение рН является изоэлектрической тг)чкой этой фракции. Оставшуюся часть активной средней фрак15 ции осаждают при рН 4,8 с помощью 0,1 N НСI. Центрифугировяние прп 0 С в течение 5 мин дает количественный выход активности Г>8 }З42 равд<льни рястворян>т н воде, прнчеM pll реl vлирук>т до 8,5 при п<>мощи 0,1 N ряс>вор» МН<ОН. Затем рН прозрачного расти<>ра Ii<)водят до 5,0 при помощи 0,1 М l l(:OOII, при этом происходит осаждение. Каждый осадок смешивак>т с 10 мл суспензии Био- Геля Р-2, уравновешенного водным раствором 0.02 М НСООН и 0,2 М Н(.ООНМН,> с получением р1! 5,0. Каждую из этих смесей помешан>т в верх колонки с 15 мл Био-Геля P-2, обработанной силиконом. Гель HBxo>lHTcH на неболь>пом куске стекловолокна. Для элюирования <>cBilK<>R применяк>т градиент рН. С помощью градиентного смесителя вь>держивают рН около 5 в течение короткого периода времени для промывки осадка, зятем рН постепенно снижак>т до 2,8 и наконец увеличивают до 9,0. Буферная система состоит из 0,02 М НСООН вЂ”Н(ОООН< и 0,02 М N Н<НСΠ— NH), элюирование ведут при комнатной температуре. Расход составляет 27,2 мл/см час. Выходящую жидкость после опухолевого экстракта анализируют флуоресцентной спектрометрией (активация при 288 мкм, флуоресценция при 350 мкм}. <З>ракцию элюирования между начальным рН и рН около 3 выделяют для дальнейшего использования. После лиофилизации и вымораживания продукт можно хранить в герметичных ампулах после откачки воздуха при минус 24 С. Для характеристики размера молекулы и подтверждения чистоты антигенный материал в виде раствора фильтруют через Ьио-Гель Р-30> который уравновешивают буфером 0,02 М HCOOH — HCOONH4 рН 3,0. Элюировянный СРПА растворяют в небольшом количестве этого же буфера. Расход 3,25 мл/см час, собранные фракции 1,25 мл. Активные фракции показывают максимум спектрофотометрического поглощения при длине волны 229 — 233 мкм и флуоресценцию при 350 мкм, если активация шла при 288 мкм. 10,4 мг СРПА, растворенные в 3,0 мл указанного буферного раствора обрабатывают на силиконизированной колонке с Био-Гелем Р-30 и получают полное выделение обоих веществ и активности. Объем элюирования сопоставим с молекулярным весом 22000 — 24000. После вымораживания получают белый гигроскопический порошок, который можно хранить на холоде, в темноте, без доступа кислорода. В продукте отсутствуют углеводы и нуклеиновые кислоты. Анализ при помоц и аминокислот показывает соответствие с молекулярным весом, определенным по гелевой фильтрации. Анализ аминокислот показывает следуюгцее распределение веществ по молярным процентам с точностью до ++5 /0 . алании 8,62, яргинин 4,57, аспартовая кислота 10,39, цистеин 0,95, глутамовая кислоты 17,04, глицин 6,87, глистидинl,0, изолейцин 4,75, лейцни 10,49, лизин 3,69, метионин 1,91, фенилал»нин 2,75, пронин 3,79, серии 7,74, треонин 5,92, тирозин 3,21, валин 6,36. Содержание аминокислот соответствует <.<>рот>4 <ескому содержанию азота !6,2--17,8 /0, <» //риме/> 2. !1олуч< н>с<. СРПА-альбуминового компл< кся. I!с>рсшн> (.!>I I >><, п<>лученнун>»н»л<>с ич>к> примеру I, р»<хвор»н» в муравьиной кисл<>>с (н»пример 0,(}, ) Л1, pll 2 3). Получают прс>зр»ч нь>й раствор. К этому раствору дс>6яв »»<)T порошок альбуминя или раствор я,>>бумин» при таком же р!1. кяк у раствора муравьиной кислоты (200 вес, ч, яль6умина на I вес.ч. (.PI!A), н получя>от прозрачный раствор СРГ1А и альбуминя. Зятем рН раствора медленно увеличивают до6»влением основания (например водного >ц раствора едкого патра или аммиака) до рН 7,5. Получают прозрачный раствор, содержащий (.PlIA и яль6умин в виде комплекса. Этот раствор, содержащий 12 мкг СРПА/мл, можгт быть использован для диагностики или может бьггь выделен вымораживанием комп1s лекс в виде белого порошка. Порошок стабилен на холоде (плюс 4 С) в течение длительного времени. Максимальное использование активности (;Р!1Л достигается при весовом соотношении »льбумина к СРПА равном или боль>ие 200: I. Получение дубленых и меченых красных кровяных телец. Свежую кровь овцы (1 об. ч.) добавляют к стерильному раствору Алсеверя (1,2 о6. ч. ) . Раствор Алсевера готовят из 250 г глюкозы, 80 г дигидрата цитрата натрия, 42 r N»C;I н воды до 10 л, рН доводят до 6,1 при помощи 100/,-ного моногидрата лимонной кислоты Смесь центрифугируют и эритроциты снова cvcпендируют в растворе Алсевера и дважды в буферном растворе при рН 6,8. 30 Создают суспензию эритроцитов в буферном растворе при рН 6,8 концентрацией ! О эритроцитов в мл на 1 объем суспензии эритроцитов, полученной как указано, добавляют при перемешивании к 1 объему буферного раствора при рН 6,8, содержащему около ! 8 мкг дубильной кислоты на 1 мл. Дубленые таким образом эритроциты центрифугируют и дважды суспендируют в буферном растворе при рН 7.5. Далее эритроциты суспендируют в буферном растворе при рН 7,5 концентрацией l 0 эритроцитов на 1 мл. Порцию полученного комплекса СРПА растворяют в буферном растворе при рН 7,5 и получают концентрацию СРПА 3 мкг/мл (расч ита но по чистому СРПА) . Добавляют 1 об. ч. суспензии дубленых эритроцитов по 45 каплям при 0 С к 1 об: ч. раствора СРПА комплекса в течение 10 мин. Меченые эритроциты центрифугируют и снова суспендируют в буферном растворе при рН 7,5, содержащем стабилизируюц(ее количество инертной человеческой сыворотки, и получают суспензию, солержягцую 1,6 !Ол меченых клеток в мл. Эти меченые клетки применяют для методики диагноза. Пример 3. Получение антител. Для перенося полипептидов в активном <)55 c1оянии к клеткам, продуцирук><цим а»тителя, нео6ходимо содержать полипептиды в р;>створ< при рН ниже 3 (002 М НСООН, рН 2,8) и эмульгирс>вать раствор в масле до <>6рязс>нянин черезвы айно малых кащль, защиш<нных ел<> ем м»сла. И>съ<кция такой эмульсии 0p»n<>днс 60 к <н>р»зон»пню удовлетнорительногс) к<>лн ц< > 9 ва антител, которые специфично1реагируют с СРПА н реакциях склеивания красных кровяных телец, в которых клетки крови мечены СРПА. Получение иммунизируюшего реагента. 816 мкг чистых СРПА, полученных иа храняшихся раковых опухолей человека, растворяют в 1 мл 0,02 М НСООН при рН 2,8. К этому раствору по каплям добавляют 1,0 мл вспомогательного масла при эмульгировании, Эмульгирование ведут по Фройнду шприцем для инъекций. Смесь втягивают и вьп|ускают из шприца до образования гомогенной эмульсии белого цвета, имеющей консистенцию взбитых сливок, Одна капля этой эмульсии при испытании с ледяной водой отдельно плавает и остается неповрежденной. Полученную полутвердую эмульсию применяют для подкожных и внутримышечных инъекций кроликам. Иммунизация пяти кроликов. В первой инъекции применяют, так называемое полное вспомогательное вещество, а в последуюгцих инъекциях, неполное вспомогательное вещество. После начального отбора крови у каждого из пяти кроликов для установления Π— величин, им подкожно вводят справа и слева по 408 мкг эмульгированных СРПА при рН 2,8. С интервалами в десять дней вводят еще три инъекции, первую внутримышечно в задние лапы, а вторую и третью соответственно в переднюю и заднюю часть, Выбирают место инъекции, исходя из использования приемных участков региональных лимфатических желез. Всего каждый кролик получает около 1,6 мкг СРПА в виде эмульсии. Через 14 и 24 дня после последней инъекции берут пробы крови для анализа на склеивание красных кровяных телец для определения наличия специфичных антител против СРПА. Через два дня после отбора последней пробы спускают максимальное количество крови, выделенной в виде сыворотки, которую стерильно фильтруют и переносят малыми порциями в стерильные пробирки. Эти пробирки можно хранить на холоде при поддержании специфических условий. Процедура диагностики. Анализ крови основан на показании наличия СРПА по модифици.рованной методике подавления слипания красных кровяных телец (микрометод). Сыворотку пациента (25 мкл), сорбированную красными кровяными тельцами овцы, титруют в восемь стадий двумя разбавлениями в разбавительных пластинах Линдро 15 MQ С вЂ” 96, затем в каждую полость добавляют 25 мкл специфичной иммунной сыворотки при предельном разбавлении (1:2000). После инкубации при 22 С в течение 10 мин в каждую полость добавляют по 50 мкл суспензии около 6 — 8 миллионов красных телец крови овцы, задубленных и меченных выделенными СРПА, комплексированными с человеческимм альбумином (2 — 4 миг на 10 клеток крови). Вместо эрнтроцитов можно применять другие порошкообразные носители, например латекс, бентонит или коллодий..Геакцию записывают при помощи наклонного зеркала и стандартной серии через 4 — 24 час после инкубацнн при 1 — 2 С. 581842 Статистический анализ экспериментальных данных показывает, что существует важная зависимость между диагнозом рака и увеличенной концентрацией СРПА (P < 0,001). То же относится к соотношению между размером массы рассматриваемой опухоли и увеличенной концентрацией СРПА (Р (0,001). Независимо от типа и локализации установлено, что раковые опухоли содержат СРПА, вследствие чего СРПА являются общими для всех типов рака, т. е. злокачественных опухолей эпитфлийного происхождения. Формула аобретекия Способ получения антигенов путем обработки гомогенизированных тканей органическими растворителями. лиофилизацией осадка и повторной гомогенизацией его при низкой т мперату ре с последующим гидролизом ПИдроокисью натрия, обработкой хлористым натрйач, осаждением в и3аэлектрической точке и растворением осадка в буфере, отличающийся тем, что. с целью п вышения специфичности антигенов, растворенные в буфере белки фильтруют через гель собирают фракции мол вес. 10. 10 — 20. 1О и повторно фильтруют через . гель, собирают первую активную порцию. дЮ50 Для контроля применяют: а) клетки крови. меченные СРПА, плюс иммунная сыворотка; б) клетки крови, меченные СРПА, без иммунной сыворотки; в) сыворотку больного плюс клетки крови, меченные человеческим альбум ином; г) сыворотку больного и необработанные клетки крови; д} клетки крови, меченные СРПА, и антитела в одной серии, где ингибирование обеспечено ступенчатым уменьшением известных количеств СРПА. )о Жидкости для разбавления содержат соединенную от многих людей инактивированную нейтральную сыворотку для стабилизации клеток крови. Реагент СРПА получают из хранящихся раковых тканей человека, очищают его с по15 мошью гелевои фильтрации, элюирования рНградиентом, фильтрованием через Био-Гель Р-30 и комплексированием с альбумином, В качестве иммунной сыворотки применяют лошадиную анти-Не-La, сорбированную нормальной тканью, и запасную человеческую сыворотку. Иммуннизацию проводят промытыми фрагментами Не-Lа клеток„выращенных на среде Игла, содержащей 20 /О инактивированной человеческой сыворотки в плоских стеклянных бутылках. Клетки собирают с помощью 25 ЕДТА, центрифугируют и три раза промывают водой. При наличии в сыворотке большого СРПА лошадиные антитела нейтрализуются, при этом не наблюдается склеивания при последующем добавлении клеток крови, меченных полипептидами. Регистрацию ведут по воззо растающей шкале от. О до 6, где О„указывает на отсутствие ингибнрования, а 6 — йа максимальное ингибирование склеивания. Записи делают без учета состояния здоровья больного. ll 58184 водят до рН 5,0, соединяют осадок с гелем мол. вес. 2.000 уравновец1енным буфером цри рН около 5,0. ломен1ают на колонку с тем же 2 ! 2 гелем, элк)ируют растворами со снижающимся градиентом рН и собирают фракцию, элюируемую при рН 3,0, Составитель С. Малютина Редактор Е. Кравцова Техред О. Луговая Корректор Д. Мельниченко. Заказ 3930/1 Тираж 677 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий I 13035, Москва, )К-35, Раушская наб., д. 41о Филиал ППП «Патент», г. Ужгород, ул. Проектная, 4
