Способ получения -лизина
ОП ИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕН ИЯ
К ПАТЕНТУ
Союз Советских
Социалистических
Республик (") 826295
Г
1 (61) gIîïîëíèòåëüíûé к патенту (22) Заявлено 26.04.73 (21) 1912978/13
I (51) М. Кл.
С 12 Р 13/06 (23) Приоритет — (32) 27.04.72; 18.08.72;
1 9.09.72; 30.1 1. 72; (31) 42527; 82641; (33) Япония
94030; 120247 (43) Опубликовано25.08.76.Бюллетень № 31
Государственный комитет
Совета Министров СССР по делам изооретений и открытий (53) УДК 663.1 (088.8) (45) Дата опубликования описания 15.12.76
Иностранцы
Кодзи Кубота, Ясухико Есихара, Хаяо Хиракава, Хиротака Камидза, Сигеки Носака, Фумихиро Есинага, Синдзи Окумура и Хироси Окада (Япония) (72) Авторы изобретения
Иностранная фирма
"Адзиномото Ко, Инк." (Япония) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 1 -ЛИЗИНА
У-108 АТСС 21798, АС-73 АТСС21799, АД-5 АТСС 21800, АД-162 АТСС21801, AT -3424 ФЕРМ P-171 1, AI -3425 ФЕРМ
Р-1712, AT -3429 ФЕРМ Р-1857, AJ—
3391 ФЕРМ P-1570, А3 -3394 ФЕРМ
P-1573, AJ -3395 ФЕРМ P-1574, АТ—
3396 ФЕРМ Р-1575, AI -3392 ФЕРМ
Р-1571 или AY -3393 ФЕРМ P-1572. Из рода Со yhebac P-1984 или AT -3461 ФЕРМ P-1985, вид 3 Ици штамм АТ 34-64 ФЕРМ P-2026, вид aaetoacidophlfum штамм AI -3465 ФЕРМ P-2027. В качестве ассимилируемого источника углерода можно использовать углеводы, уксусную кислоту, этанол, В качестве необходимых для роста веществ можно применять природные вещества. В качестве аналога L -лизина рекомендован Я -(2-амино)- 1 -цистеин (АЭ11). Индекс ФЕРМ P указывает на то, что штамм хранится в Исследовательском институте ферментации Управления прикладИзобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к получению аминокислот с помощью микробной ферме нтац и и. Известен способ получения -лизина путем выращивания продуцирующих его микроорганизмов, относящихся к одному из poaos3vevibachep urn Гovynebackevium, устойчивых к аналогам Ь -лизина, в питательной среде, содержащей усваиваемые источни- щ ки углерода и азота, неорганические соли, необходимые питательные вещества и органические вещества, стимулирующие рост, при рН от 5 до 9 (11. С целью упрощения процесса и повыше- И ния выхода Ь -лизина из родовБ ещ5ас1а чцт и Cotvnebactev um предложено использовать мутантные штаммы, обладающие наряду с устойчивостью к аналогам лизина потребностью по крайней мере в одном соеди- Qp ненни, выбранном из группы, содержащей серии, пролин, алании, никотинамид,пантотвновую кислоту, тиамин, гуанин, гипаксантин и витамин В, а именно из родаЗт.еМЬас1еицтп используют вид 1псМеипеиЬ тп штамм 25 526295 ной науки и технологии Министерства торговли и промышленности Японии, откуда этот штамм может быть получен, Мутанты, нуждающиеся в определенном питательном веществе, были получены путем облучения исходного штамма рентгеновыми лучами или обработкой нитрозогуанидином и последующего выращивания кслоний на твердой питательной среде при 31оС в течение 4-10 суток. tO Питательная потребность выделенных ауксотрофных мутантов была определена известным способом. Мутации устойчивости к аналогу L -лизина были получены путем повторной обработки ауксотрофных мутантов нитрозогуанидином и выращивания их на синтетической питательной среде с добавлением аналога и необходимого питательного вещества. Некоторые мутанты были получены путем первоначального получения мутации устойчивости к аналогу лизина и последующего введения мутации ауксотрофности. Преимуществом данного способа является получение нового типа мутантов, способ-, ных образовывать значительные количества L --лизина. Другим достоинством этого способа является отсутствие резкого влияния на биосинтез L -лизина колебаний в содержании L -треонина так как штаммы устойчивы к аналогам L -лизина. В качестве ферментационной среды можно использовать обычные среды, широко применяющиеся в производстве L -лизина. Необходимо только, чтобы в питательной среде присутствовали вещества, нужные для роста мутанта. К числу таких веществ относятся аминокислоты серин, пролин, аланин, лейцин, различные витамины, например щ витамин В, тиамин, пантотеновая кислота, никотинамид (или никотиновая кислота), пуриновые основания, например гуанин, аденин, шпоксантин, белковый гидролизат соевых бобов, дрожжевой экстракт, пептон, 45 гидролизат казеина и др. Одним из важных факторов процесса ферментации является содержание в среде требуемых аминокислот и других питательных веществ в количестве ниже того уровня, который является оптимальным для роста штамма. Ферментацию проводят при аэрировании и перемешивании, в течение 24-96 час при температуре 24-37оС. рН среды поддерживают на уровне 5,09,0. Если рН среды в процессе ферментации становится меньше 5, то в среду добавляют мел или водный раствор аммиака. Если в качестве источника углерода используют органические кислоты, то рН имеет тенденцию к повышению и его доводят до необходимого уровня с помощью кислот, например органической кислоты, которую используют в качестве источника углерода, а также с помощью соляной или серной кислоты. -лизин выделяют из культуральной жидкости обычными методами. Бактериальные клетки могут быть отделены фильтрованием или центрифугированием, а лизин может быть извлечен с помощью катионнообменной смолы. Полученный L -лизин идентифицируют с помощью бумажной хроматографии, методом электрофореза, микробиологическим методом или с помощью лизиндекарбоксилазы. Пример 1. Готовят питательную среду следующего состава: глюкоза — 10,0 /о, (й Н ) Я О„- 5,0%т КН РО4 - О, 1%> Mg gO Среду разливают по 20 мл в качалочные колбы объемом 500 мл и стерилизуют. Колбы засевают штаммами, указанными в табл. 1. 526295 Табл ица Выход L -лизина, г/100 мл среды Шта мм Brev bactet ЦасСоЕе .веп4 и m У-108 (ФЕРМ P-1443) АТСС 21798 Влечь Ьас еи ит 3ас6оЕе ment urn 4,1 АС-73 (ФЕРМ P-1444) АТСС 21799 Н еиЬас ем um 3actoferrnenturn 2,5 АД-5 (ФЕРМ P-1445) АТСС 21800 В емЬасЕвиum Вас1оКе mentum АД-162 (ФЕРМ P-1446) АТСС 21801 3,0 2,8 Ферментацию проводят в течение 72час на качалке при 31оС. Количество полученного L, лизина (в 2О виде гидрохлорида)указано в табл. 1. Питательная среда для штаммов АС-73 и АД-162 содержала 5 мг/л пантотената кальция и 100 мг/л аденина и гуанина соответственно. 25 Клеточную массу штамма У-108 и мел удаляют из культуральной жидкости центрифугированием. 1 л культуральной жидкости пропускают через колонку с катионообменной смолой (Амберлит 3 R-120). Затем 4 -лизин элюируют 3 /-ным водным раствором аммиака. Элюат концентрируют в вакууме. В сконцентрированный раствор добавляют соляную кислоту и помещают в холодильник для осаждения, -aaaHHe. 35 В результате получают 30,2 г неочищенного кристаллического L -лизина солянокисл ог о. П рим ер 2.Штаммытеже, что в примере 1, выращивают в посевной питательной среде следующего состава: глюкоза 1, 5% аммоний уксуснокислый — О, 3%, КН РО -0,1%, М (5О+ х 7Н О вЂ” 0,04%, ++ ++ ионы Fe и Ми по .0,2 мг %, биотин— 50 мкг/л, тиамин солянокислый - 200мкг/л, 45 белковый гидролизат соевых бобов (содержание азота 7%) — 15 мл/л и дрожжевой экстракт — 0,5%. Начальный рН среды 8,0. Посевной материал выращивают при аэрировании и перемешивании среды в течение 16 час при 31оС. 15 мл посевного материала добавляют к 300 мл ферментаци онн ой среды следующего состава: глюкоза — 3%, аммоний уксуснокислый — 0,5%, мочевина — 0,2%, КН РО— 0,1%, Mg gO+x 7Н О вЂ” 0,04%, ионы Fe u М по 0,2 мг %, биотин — 50 мкг/л, тиамин солянокислый 50 мкг/л, белковый гидролизат соевых бобов — 30 мл/л и те вещества, которые указаны в табл. 2. Начальный рН среды 7,5. Выращивание осуществляют в ферментерах при перемешивании среды со скоростью 1500 об/мин и пропускании воздуха в количестве 1 об. воздуха на 1 об. среды в 1 мин. Температура 3 1, 5 оС. В процессе ферментации рН среды поддерживают на уровне 7,2-8,0 путем автоматического добавления смеси растворов уксусной кислоты и аммония уксуснокислого в соотношении 0,25 молей аммония уксуснокислого на 1 моль уксусной кислоты, причем концентрация уксусной кислоты равна 60%; через 48 час выход I -mama солянокислого в культуральной жидкости составляет от 4,8 до 6,4 г/100 мл среды. Результаты приведены в табл. 2. 526295 Таблица 2 6,4 У-108 4,8 5,0 Пантотенат кальция АС-73 5,7 АД-5 АД-1 62 100 6,0 Аденин Гуанин 15 мл каждой посевной культуры добав ляют к 300 мл ферментационной среды следующего состава: глюкоза — 1,0%, этанол1,5%, (1Ч Н ) GО, — 0,5%, мочевина — 0,2%, КН РО, — 0,1%, МАЗО х 7Н О вЂ” 0,04%, ионы Fe+ и Мп цо 0,2 мг %; биотин— 50 мкг/л, тиамин солянокислый — 50 мкг/л, белковый гидролизат соевых бобов — 30мл/л и те вещества, которые указаны в табл. 3. Начальный рН среды 7,5. Таблица 3 У-108 АС-73 5,5 Пантотенат кальция 5,0 4,4 5,5 Аденин Гуанин АД-162 100,0 100,0 5,7 Выращивание проводят в ферментерах 45 при перемешивании среды со скоростью 1500 об/мин и пропускании воздуха в количестве 1 объем воздуха на 1 объем среды в 1 мин. Температура 31,5оС. В процессе ферментации рН среды поддерживают на уровне 7,0-7,5 путем добавления газообразного аммиака. Количество этанола в среде определяют с помощью газовой хроматографии и добавляют по мере надобности, когда содержа- 65 ние его в среде ниже 0.3%. B табл. 3 приведены данные по содержанию L -лизина солянокислого в культуральной жидкости каждого штамма после 48 час ферментации. 60 Результаты по выходу, -massa после 72 час ферментации приведены в табл. 4. Пример 3. Штаммы те же, что в примере 1, выращивают в течение 16 час на качалке при 3 1,5оС в посевной среде следующего состава; глюкоза — 1,5%, мочевина — 0,3%, КН РО,„— 0,1%, Ng 50 х _#_ +4 +Ф х7Н О вЂ” 0,04%, ионы Fe — Mn по0,2 мг%, биотин — 50 мкг/л, тиамин солянокислый— 20 мкг/л, белковый гидролизат соевых бобов - 15 мл/л и дрожжевой экстракт— 0,5%. Начальный рН среды 8,0. Л Пример 4. Штаммы — продуценты: Н еа Ъас1еиим 9псЫФе мел Ыт ЛХ— 3391 (ФЕРМ P-1570), АХ -3392 (ФЕРМ P-1571), AT -3393 (ФЕРМ P-1572), 3394 (ФЕРМ P-1573), А7 -3395 (ФЕРМ P-1574), A3 -3396 (ФЕРМ P-1575). Состав среды и условия культивирования аналогичны примеру 1 за тем исключе нием, что добавляют белковый гидролизат соевых бобов в количествах, указанных в табл. 4, а в среду для штамма AJ -3396 добавляют 50 мл/л гипоксантина. 526295 Таблица 4 3,0 2,9 1,5 5,0 1,5 4,6 3,0 3,5 2,0 3,1. 3,0 3,0 Таблица 5 5,4 7,1 7,0 6,5 5,8 6,1 50,0 Таблица 6 5,2 6,3 6,3 6,1 5,0 5,5 50,0 AJ -3391 Aj -3392 AJ -3393 AJ -3394 AJ -3395 АУ -3396 Пример 5. Штаммы — продуценты те же, что в примере 4. Ферментацию проводят с использованием в качестве основного источника углерода уксусной кислоты так, как это описано в А3 -3391 AJ -3392 А3 -3393 A3 -3394 АУ -3395 AJ -3396 Пример 6. Штаммы — продуценты те же, что в примере 4. Ферментацию проводят с использованием в качестве основного источника углерода этанола, как это описано в примере 3, за АХ -3391 A3 -3392 AJ -3393 АХ -3394 А3 -3395 А3 -3396 примере 2 за тем исключением, что в среду для штамма А3 -3396 добавляют 50мг/л гипоксантина. Данные по количеству 4 -лизина солянокислого через 48 час ферментации приведены в табл. 5. щ тем исключением, что в среду для штамма AJ -3396 добавляют 50 мг/л гипоксантина. Данные по выходу лизина через 48 час ферментации представлены в табл. 6. 526295 Количество полученного Выход, % от испольлизина, г/100 мл среды зованной глюкозы Штамм А3 — 3424 АХ -3425 № 872 4,4 3,2 1,8 22 7,2 А3 -3424 Aj -3425 ¹ 872 6,1 4,0 Для штаммов AI -3392 и AJ -3393 вы ход лизина 6,3 г/100 мл среды, что составляет 27,7% относительно использованного этанола. Пример 7. Штаммы — продуценты: Вму ЬаС еиов Всего(е щеи и э AJ— 3424 (ФЕРМ P-1711), AJ -3425 (ФЕРМ P-1712) и № 872 (контроль). Состав среды и условие культивирования аналогичны При мер 8. Штаммытеже, чтов примере 7, выращивают в течение 18 час на качалке при 31оС на посевной среде следующего состава: глюкоза — 1,5%, аммоний уксуснокислый — 0,3%, мочевина— 0 1%, КН РО - 0,1%, Ng ВО 7Н О Ф+ ++ 0,04%, ионы Fe и Мп по 0,2 мг %, биотин — 50 мкг/л, тиамин солянокислый— 200 мкг/л, белковый гидролизат соевых бобов (содержание азота 7%) — 2%. Начальный рН среды 7,5. Состав ферментационной среды: глюкоза — 2%, аммоний уксуснокислый — 0,5%, мочевина — .0,2%, КН РО+ — О, 1%, Ng ЯО х 7Н О вЂ” 0,04%, ++ ++ ионы Fe и МИ цо 0,2 мг %, биотин— 50 мкг/л, тиамин солянокислый — 50 мкг/л, белковый гидролизат соевых бобов (общий азот 7%) — 2,5%. Начальный рН среды 7,5. После стерилизации к 300 мл ферменПр и мер 9. Штаммытеже, чтов примере 7. Посевной материал выращивают в среде такого же состава, как описано в примере 8, но вместо уксуснокислого аммония добавляют 0,5% этанола и 0,3% мочевины. Выращивание осуществляют в течение 18 час при температуре 31оС в условиях аэрирования. примеру 1 за тем исключением, что в среду добавляют 200 мкг/л тиамина солянокислого, а в среду для штамма АХ -3425 дополнительно добавляют 3% белкового гидролизата соевых бобов. Данные по выходу L -лизина солянокислого через 72 час ферментации представлены в табл. 7i Таблица 7 2О тационной среды добавляют 15 мл посевного материала. Ферментацию ведут в стеклянных ферментерах общим объемом 1 л при перемешивании со скоростью 1500 об/мин и про пускании воздуха со скоростью 1 объем воздуха в расчете на 1 объем среды в 1 мин. Температура 31-33оС. B процессе ферментации рН среды поддерживают автоматически на уровне 7,28,0 путем добавления смеси растворов уксусной кислоты и аммония уксуснокислого в следующем соотношении: 0,25 молей уксуснокислого аммония на 1 моль уксусной кислоты. Концентрация уксусной кислоты 60%. Данные по выходу L -ammu салянокислого через 55 час ферментации представлены в табл. 8. Таблица 8 фермептацию ведут аналогично примеру 8, но в ферментациониую среду вместо ук суснокислого аммония добаигщют 1% глюк<ьЭ зы, 1% этанола и 0,5% серж ивсааго аммония B процессе ферментации рН среды поддерживают as уровне 7,2-8,2 путем добав ления газообразного аммиака. фр Количество этанола в среде определяют 526295 Таблица 9 А3 -3424 Aj -3425 № 872 6,6 5,6 3,6 Пример 10. Штамм Brevibgcie iue Ьс1ойииаиМю А3 -3429 (ФЕРМ P1857). Посевной материал выращивают в бульоне. Готовят ферментационную среду следующего состава: глюкоза — 10%, (N Н ) 804 4,5%, КН РОд — 0>1%, Ng ЯО х 7Н О вЂ” 0,04%, ионы Fe u N n по 0,2 мг% сд биотин — 50 мкг/л, тиамин солянокислый200 мкг/л, белковый гидролизат соевых бобов (общий азот 7% ) — 1%, СаСΠ— 50/о. Начальный рН среды 7,0. Среду разливают по 20 мл в качалочные колбы объемом 500 мл и стерилизуют 5 мин при 110оС. Ферментацию проводят в течение 72 час на качалке при 31оС. Выход L -лизина солянокислого составТаблица 10 2,0 А -3397 А3 -3458 А3 -3460 А3 -3461 А3 -3464 AJ -3465 3,0 4,1 3,1 2,9 3,2 экстракта, а рН среды поддерживают на уровне 7,0. В ферментационную среду, кроме того, добавляют 2,5% белкового гидролизата соевых бобов. Результаты по выходу (, -лизина после бр 55 час ферментации представлены в табл ll, с помощью газовой хроматографии и производят добавку этанола, когда его содержание в среде становится ниже 0,3%. Пример 12. Штаммы — продуценты как в примере 11. Условия ферментации аналогичны примеру 2 с использованием в качестве основного источника углерода уксусной кислоты за тем исключением, что в питательную среду дополнительно добавляют 0,5% дрожжевого Данные по выходу ь -лизина солянокислого после 48 час ферментации приведены в табл. 9. ляет 5, 1 г/100 мл среды (5 1% выхода в расчете на потребленную глюкозу). Пример 11. Штаммы — продуценты: 0оииеЬас1еиии g3u4qvicum AJ -3397 (ФЕРМ P-1613), Aj -3458 (ФЕРМ P— 1982), АХ -3460 (ФЕРМ P-1984), AJ— 3461 (ФЕРМ Р-1985), gorynebaa В ийч АХ -3464 (ФЕРМ Р-2026) и 1о меЬасЫ и п асе оасiдорЬ Iu e AJ— 3465 (ФЕРМ P-2027). Состав сред и условия культивирования аналогичны примеру 10 за исключением того, что в среду для штамма A3 -3460 дополнительно вводят 0,5% дрожжевого экстракта. Данные по выходу -лизина после 72 час ферментации представлены в табл.10. 526295 Таблица 11 Получено .4 -лизина, г/100 мл среды Расход уксусной кислоты, % Штаммы 5,0 AJ -3397 А3 -3458 АЗ -3460 A3 -3461 А3 -3464 AJ -3465 5,2 23,5 4,7 6,4 5,5 5,8 0,2 мг %, биотин — 50 мкг/л, тиамин солянокислый — 50 мкг/л, белковый гидролизат соевых бобов (общий азот 7%) — 2,5%. Начальный рН 7,5. После стерилизации 300 мл ферментационной среды засевают 15 мл посевного материала. Ферментацию ведут в стеклянных ферментерах объемом 1 л при температуре 31-33оС, перемешивании и продувании 1 объема воздуха в расчете на 1 объем среды в 1 мин. В процессе ферментации рН среды поддерживают на уровне 7,2-7,8 путем добвления газообразного аммиака. Количество этанола определяют с помощью газовой хроматографии и добавляют его при падении уровня этанола в среде ниже 0,3%. Данные по выходу Ь -лизина после 48 час ферментации представлены в табл 12. Таблица 12 4,8 А -3397 AJ -3464 А3 -3465 20,5 4,1 24,0 4,6 1. Способ получения L -лизина путем выращивания продуцирующих его микроорганизмов, относящихся к одному из родов В МЪас1еииж, Сом иеЬасЛеиию устойчивых к аналогам лизина, в питательной сре- 55 це, содержащей усваиваемые источники углерода и азота, неорганические соли и органические вещества, стимулирующие рост, при рН от 5 до 9, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью упрощения процесса бв Пример 13. Штаммы — продуценты: L,or > пеЪас1еии и ф1и1а я съ ж А3 -3397 (ФЕРМ P-1613), Corsrrebac(eriurrr 3B u rrr АХ -3464 (ФЕРМ Р-2026, Corvneh cherium асе1оас дорй ив AJ -3465 (ФЕРМ 20 P-2027) . Состав посевной среды: глюкоза — 1,5%, мочевина — 0,3%, КН РОф Оу 1%, М О4 х х7Н О вЂ” 0,04%, ионы ГЕ и Ми лоб,2мг%, биотйн — 50 мкг/л, тиамин солянокислый — Ж 200 мкг/л, белковый гидролизат соевых бобов (общий азот 7%) — 1,5%. Начальный рН 7,0. Посевной материал выращивают в течение 18 час при 31оС при перемешивании ЗО и аэрации. С остав ферм ентаци онн ой среды: глюкоза 1%, этанол — 1%, (N Н ) О4,— 0,5%, мочеBHHG — 0,2%, КНеРΠ— О, 1%. М ЯО х 7Н О вЂ” 0,04%, ионы Fe u Nrr no 35 Формула изобретения и повышения выхода продукта, из родов3. енЫАеииа и СоилеЬас еи urrr используют один из мутантных штаммов, обладгиощих наряду с устойчивостью к аналогам лизина потребностью по крайней мере в одном соединении, выбранном из группы, содержащей серии, пролин, алании, никотинамид, пантотеновую кислоту, тиамин, гуанин, гипоксан тин и витамин В„, а именно, из рода ВгеЙЬайеиил используют вид В.вас1о1е мепЫ и, штамм У-108 АТСС 21798, АС-73 АТСС 21799, АД-5 АТСС 21800» 526295 Составитель Л. Минеева Редактор А. Бер Техред А. Богдан Корректор С. Шекмар Заказ 5044/476 Тираж 575 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 Филиал ППП " Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, АД-162 АТСС 21801, AJ -3424 ФЕРМ P-1711, AJ -3425 ФЕРМ P-1712, AJ— 3429 ФЕРМ P-1857, A3 -3391 ФЕРМ P-1570, А1 -3394 ФЕРМ P-1573, Aj— 3395 ФЕРМ P-1574, А3 -3396 ФЕРМ ь P-1575, AJ -3392 ФЕРМ P-1571 или AJ -3393 ФЕРМ P-1572, из рода Согчпеbacter m используют вид С.gLuha m cwm штамм АУ -3397 ФЕРМ P-1613, AJ— 3458 ФЕРМ P-1982, AJ -3460 ФЕРМ )p Р-1984 или А3 -3461 ФЕРМ P-1985, вид С. <)sum rrrraMM AJ -3464 ФЕРМ P-2026, видС.acehoacidoph4 Iud, штамм AT -3465 ФЕРМ P-2027. 2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю — l5 шийся тем, что в качестве ассимилируемого источника углерода применяют углеводы. 3. Способ по и. 1, о т л и ч а ю— ш и и с я тем, что источником ассимили- 20 руемого углерода является уксусная кислота. 4. Способ по и. 1, о т л и ч а ю— шийся тем, что источником ассимилируемог о углер ода является этан ол. Л 5. Способ по п. 1, о т л и ч а юшийся тем, что аналогом 1 -лизина является S -(2-аминоэтил)-, -цистеин. 6.Способпоп. 1, отл ичаюшийся тем, что в качестве необходимых для роста веществ применяют природные вещества. Приоритет по и. 1 по признакам: 27.04.72 -Breve 1.ас1о1еииеи1о и У-108 АТСС 21798;Вгеч Lackofermenku m АС-73 АТСС 21799; Вгеч» Lachoferme tum АД-5 АТСС 21800;Вгеи Lactofermentum АД162 АТСС 21801; 18.08.72 — Вгеч Lactofermenium АХ -3391 ФЕРМ Р-1570;Вгеи Lactofer medium AT -3392 ФЕРМ P-1571 Вгеч 1.ас1о1егrnentum AJ -3393 ФЕРМ P1572;Вгeч ас оГегмеи1ам AT -3394 ФЕРМ P-1573:Вгеа Lactofermevkum А3 -3395 ФЕРМ Р-1574; Breve Lactofcrme u w A3 — 3 3 96 ФЕРМ Р-1 5 75; 19.09.72 Согчие Ы1ав сию АУ— 3397 ФЕРМ P-1613; 30.11.72 -Вгеч 4ас1о1егтеЫит AT -3425 ФЕРМ P-1 712; Brey Lackof ermentum AJ -3424 ФЕРМ P-1711. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе: 1. Патент ФРГ № 2034406, кл. 6в16/03.
