Способ количественного определения энзимов гидролитического действия

ОПИСАНИЕ„„

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

Союз Советских

Социалистимеских

Республик (51) Дополнительный к патенту (22) Заявлено15 08.72 (21)1819712/23-4 (51) M. K G 01N 21 24 (23) Приоритет - (32) 16. 08.71

Гасударственный комитет

Совета Министров СССР ао делам изобретений и открытий (31) 172280 (33) CII;A (43) Опубликовано25. 05.76 Бюллетень №19 (53) УДК 543.42. 062 (088.8) (45) Дата опубликования описания 13.10.76 (72) Автор изобретения

Иностранец

Po6epr Юджин Смит (CILä) (71) Заявитель (54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭНЗИМОВ

ГИДРОЛИТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ

Изобретение стносится к способам определения концентраций энзима с применением

4-метокси2» нафтиламидов.

Известен способ количественного опреде ления энзимов гидролитического действия, например трипсина, путем дсбавления к исследуемой пробе субстрат-буферного .раст вора, в котором в качестве субстрата используют tt -нитроанилид- NL -бензоил»)), g аргинин, инкубирования смеси в течение щ о

10 мин при 25 С, введения соляной кислоты, раствора нитрита натрия и через 5 мин раствора сульфаминовой кислоты с после дующими добавлением содового раствора хромотроповой кислоты, выдерживанием псм 15 лученной смеси в течение 5 мин, фотометрированием и определением Количества энзима по калибровочному графику.

Однако известный способ обладает невы сокой чувствительностью. 20

С целью повышения точности определения, предлагается в качестве субстратов гидролитического действия энзимов использовать g -аминокислотные производные

4-метокси«2-нафтиламида обшей формулы 25 где Р содержит по меньшей мере, одну группировку аминокислоты.

Способ определения энзимов гидролити ческого действия состоит в том, что к пробе анализируемого вещества добавляют М аминокислотное производное 4-метокси . 2 нафтиламида, инкубируют полученную смесь с последующими введением в полученный раствор средства, образующего краситель, фотометрированием и определением энзима по калибровочному графику.

Для определения концентраций энзимов было применено весьма большое количест во иеметоксилированных соединений данного типа. Найдено, что в результате введения к етоксi радикала эти соединения известного уже типа приобретают существенно улучшен ные свойства в отношении определения кон«

515471 ценграций энзима в гомогенных средах, (таких, как сыворотка или экстракты тканей).

К метоксилированным соединениям пред почтительно добавлять буфер. обеспечиваю .ший поддержание оптимального или близкого к нему значения водородного показателя для данного энзима. Если нужно содействовать процессу солюбилизации соединения,. то можно также добавлять пропиленгликоль.

Эту смесь смешивают с гомогенатом, содер- 10 жашим энзим, подлежащий определению, после чего дают энзиму обеспечивать гид ролиз соединения.

После проведения гидролиза в течение определенного промежутка времени добав- ц5 ляют денатурирующее соединение, такое как хлористоводородная или трихлоруксусная кислота, для прекращения гидролиза. После удаления осадка любого вида, который мо жет образоваться, добавляют средство, спо- 2р собное образовывать краситель с любым

4-метокси 2нафгиламином, который имеется в наличии вследствие энзиматического гидролиза субстрата.

Типичными средствами для образования 25 красителя служат прочный синий" (тетра» зотированный дио «анизидин), прочный гарнет (диазотированный 4»Омгоидазссь толуидин), прочный синий (диазотированный

4амино 2,5-диэтоксибензинилид) и гекса - 30 зотированный парарозанилин.

После образования .красителя определяют концентрацию красителя фотометрически посредством пропускания светового луча заданной интенсивности через смесь, ссь- 35 держ щую краситель, после чего измеряют интенсивность светового луча, прошедшего через смесь. Данную концентрацию энзима определяют путем сравнения со стандартной кривой, полученной путем проведения 40 ряда аналогичных определений с известными концентрациями энзимов.

Пример. Подлежащую инкубированию смесь готовят, сливая 1,5 мл субстрат буфера одного из типов, перечисленных 45 ниже, 0,3 мл препарата ткани или сыворотки и 1,2 мл 0,85 н. солевого раство ра в пробирки.

Пробирки закрывают колпачком и инкубируют 2 час при 37 С на водяной бане, 50

После инкубирования снимают колпачки и прекращают реакцию с энзимом путем добавления 0,5 мл 10 .4-ного раствора трихлоруксусной кислоты, причем образующийся осадок удаляют центрифугированием. 55

Вкаждую пробирку вводят 1,,0 мл вад ного рас.гвора, в 1 мл которого содержится 1 мг красителя прочного синего".

Затем пробирки .подвергают вибрационному воздействию в течение 15 30 сек, 60 после чего спустя 5 мин производят спект рофотометрическое определение при 520 ммк по отношению к пустой пробе. Ко» личество высвободившегося 4 метокси 2» нафтиламина отсчитывают по ранее приго товленной»стандартной кривой, отградуи рованной по 4-метокси 2 нафтиламину B пр исугствии рецептур, содержащих сыво ротку или ткани.

В приведенном процессе можно использсьвать следующие субстрат-буферы.

Для определения обшей активности аминопентидазь: применяют лейцил4меток» си 2-нафгиламид, 32,3 мг упомянутого соединения добавляют к 50 мп воды и сме шивают с одинаковым объемом О, 2 М фосфат ного буфера, рН 7, О, для образования суб» страт-буферного раствора.

Для определения активности дипептидиламичопетидазь1 (степень активности П) найденной в лизо,:ах клеток с итоиидной железы, применяют лизилаланил4метокси-2 нафгаламид, 43,4 мг упомянутого соединения добавляют к 50 мл воды и смешивают с равным объемом О, 2 М натрий какодила тного буфера, рН 5, 5, содержащего 0»5 мл хлористоводородной соли меркаптоэтиламина в виде 1, О М раствора, для образования субстрат-буферного раствора.

Для определения активности дипептиди ламинопептидазы (степень активности T катепсин С) применяют пропиларгинил»4» метокси» 2 нафтиламид. 52, О мг упомянутого соединения добавляют к 50 мл воды и смешивают с равным объемом О, 2 М натрийкаксдилаткого. буфера, рН 5,5,со держащего О, 5 мл О, 1 М раствора хло ристоводородной соли меркаптоэтиламина, для образования субстратбуферного раство ра.

Для определения активности дипептиди» ламинопентидезы (степень активности ХУ) применяют глицилпропил 4метокси-2 нафтиламид. 43, О мг упомянутого соединения добавляют к 50 мл воды и смешивают с равным объемом О, 1 М трио-хлористоводс родного буфера, рН 7, 5, для получения субстрат буферного раствора ("трис" озна чает 2-аминсь 2-оксиметил 1,3-лропандиол, поставляемый иностранной фирмой Истмен

Кем икелс» ) .

Для определения активной дипептидила» минопептидазы (степень активности III) пръ.. меняют аргиниларгинил-.4-метокси-2.-нафталамид. 59,5 r упомянутого соединения добавляют к 50 мл воды и смешивают с равным объемом трис-хлористс водородного буфера в виде 0,2 М раствора для образо вания субстрат буферного раствора.

515471

9- N-H

5 для определения трипсина и подобных

1 трипсину энзимов, таких как катепсин В и подобного трипсину энзима, найденного в веществе головок сперматозоидов, находя шихся в сперме, применяют. карбобензокси диглицил»f аргинил4 метокси 2- нафтил» амид. Для определения концентрации катепсина В1 к 50 мл воды добавляют такое ксьличество упомянутого амида, чтобы полу чить 2,0 М раствор, и смешивают с равным объемом 2, 0 М раствора натрийквкодилат-ного буфера, рН 4,8, содержащего 2 мер каптоэтанол, для получения субстрат буфер ного раствора. Вследствие изменения вели чины водородного показателя этого раствора до 6,7 его можно применить для определения концентрации энзима, подобного трипсину, найденному в выделениях зерен клеток.

Для определения концентрации трипс ина к 50 мл воды добавляют такое количество упомянутого амида, чтобы получить 2,0 мМ раствор, который смешивают с равным объемом 0,2 М"трис- -буфера при рН 7 для получения субстрат-буферного раствора. Для облегчения растворения амида к 50 мл воды можно добавить пропиленгликоль.

6 формула изобретения

Способ количественного определения энзимов гидролитического действия добав лением к пробе анализируемого вещества. субстратмбуферного раствора, инкубированием полученной смеси с последующим введением в полученный раствор средства, образующего

10 краситель, фотометрированием и определением энзима по калибровочному графику, отличающийся тем,что,с целью повышения точности определения, в качестве субстратов гидролитического дейст

15 вия энзимов используют Я -аминокислстные производные 4метокси2нафтиламида общей формулы где Я содержит„по меньшей мере, одну группировку аминокислоты.

Составитель В. Бодня

Редактор0.Кузнецова Техред А.Как ышникова Корректор Н.Стель:ax

Заказ 246/13 Изд. М 9.) Тираж Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР

\ по делам изобретений и.открытий

Москва, 113035, Раушская наб., 4

Москва, Енисейская ул., 2 "Гипроводхоз"