Способ получения рифамицина в.

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ (») 465795

Союз Йоветскнк

Соцналнстнческнк

Рвспублнк

К ПАТЕНТУ (61) Зависимый от патента (51) M. Кл. С 124 9/14 (22) Заявлено 07.10.72 (21) 1835294 31-16 (32) Приоритет 05.05.72 (31) 23926 (33) Италия

Опубликовано 30.03.75. Бюллетень № 12

Государственный коммтет

Совета Мнннстроа СССР по делам нзобретвннй н открытнй (53) УДК 615.779.931 (088.8) Дата опубликования описания 26.08.75 (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Ричард Джон Уайт (Великобритания) и джанкарло Ланчини (Италия) Иностранная фирма

«Группо Лепетит» (Италия) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РИФАМИЦИНА В

Изобретение относится к производству антибиотиков.

Известен способ получения рифамицина В, заключающийся в том, что культуру Streptomyces mediterranei АТСС 13685 выращивают в аэробных условиях на среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, в течение 24 †1 час при температуре

25 — 37 С, подкисленный фильтрат культуральной жидкости экстрагируют органическим растворителем, например этилацетатом органический экстракт экстрагируют фосфатным буфером рН 7,0 — 7,5 с последующим выделением целевого продукта.

Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта.

Достигается это тем, что в качестве продуцента рифамицина В используют ранее не описанный штамм АТСС 21789 Streptomyces

mediterranei.

Предложенный штамм Streptomyces mediterranei АТСС 21789 имеет следующие особенности на различных питательных средах (определение окраски проводят по методу

Мерца и Поля).

Овсяный агар. Рост сильный, поверхность гладкая, вегетативный мицелий зеленоватооранжевый с тенью янтарного цвета, воздушный мицелий отсутствует; желто-зеленый ра5 створимый пигмент.

Дрожжевой экстракт, сахарный агар. Рост сильный, морщинистая поверхность, вегетативный мицелий янтарно-коричневый с оранжево-коричневыми краями, следы розовато10 воздушного мицелия; темный янтарно-коричневый растворимый пигмент.

Сахарный агар Эмерсона. Рост сильный, поверхность гладкая, вегетативный мицелий оранжевый, воздушный мицелий отсутствует;

15 золотисто-желтый растворимый пигмент.

Агар Беннета, Рост сильный, очень морщинистая поверхность, вегетативный мицелий янтарно-коричневый с оранжево-коричневыми

20 краями, следы розоватого воздушного мицелия; темный янтарно-коричневый раствори мый пигмент.

Агар Пенассейя. Рост сильный, тонкая и гл адкая поверхность, вегетативный мицелий

25 светло-оранжевый, воздушного мицелия нет;

465795

55 б0 б5 следы светло-желтого растворимого пигмента, Дрожжевой экстракт, мелассный агар. Рост сильный, морщинистая поверхность, вегетативный мицелий горело-коричневого цвета с оранжево-коричневыми краями, следы розоватого воздушного мицелия; темно-желтый, цвета охры, растворимый пигмент.

Сахарный агар по Чепеку-Доксу. Рост сильный, гладкая поверхность, вегетативный мицелий светло-оранжевый, воздушного мицелия нет. Светлый, цвета лимона, растворимый пигмент.

Картофельный агар. Сильный рост, гладкая поверхность; янтарно-розовый вегетативный мицелий.

Сахарно-аспарагиновый агар. Рост сильный, тонкая и гладкая поверхность, светлоораняевый вегетативный мицелий; воздушного мицелия нет, растворимых пигментов нет.

Агар Придхэма. Сильный рост, гладкая поверхность, вегетативный мицелий светлооранжевый с маленькими красными пятнами, следы розоватого воздушного мицелия, желтый растворимый пигмент.

Сахарный триптоновый агар. Сильный рост, морщинистая поверхность, оранжевый вегетативный мицелий, воздушного мицелия нет; желтый растворимый пигмент.

Кобальтовый агар по Треснеру и Хикки.

Сильный рост, гладкая поверхность, вегетативный мицелий янтарно-розовый, следы розового воздушного мицелия; янтарно-розовый растворимый пигмент.

Тирозиновый агар. Сильный рост, морщинистая поверхность, вегетативный мицелий темно-оранжевый коричневатого оттенка, воздушный мицелий отсутствует, желтый растворимый пигмент; тирозиназа — ярко положительная реакция.

Агар на основании кальциевой соли яблочной кислоты. Сильный рост, гладкая поверхность, вегетативный мицелий светло-оранжевый, воздушного мицелия нет; светлый, лимонного цвета растворимый пигмент; незначительное усвоение кальциевой соли яблочной кислоты. желатин. Пигментации нет; разяижение— положительно.

Нитратный бульон. Поверхностный рост с розоватым воздушным мицелием, восстановление нитратов; бульон становится желтоватым.

Лакмусовое молоко. Ни коагулирования, ни пептонизации.

Снятое молоко. Сильный рост, гладкая поверхность, вегетативный мицелий оранжевый, желто-золотой растворимый пигмент, воздушного мицелия нет; казеиновый гидролиз — положительная реакция.

Пептонно-дрожжевой экстракт, железный агар. Средний рост, тонкая и гладкая поверхность, бесцветный вегетативный мицелий, воздушного мицелия нет; растворимого пигмента нет; выделения сероводорода нет.

Крахмальный агар. Сильный рост, гладкая поверхность. Вегетативный мицелий темноораняевый с коричневатым оттенком, большой розоватый воздушный мицелий, хромовояелтый растворимый пигмент; крахмальный гидролиз — отрицательная реакция.

Пример 1. Взвесь 10 г рифамицина В в

10 л воды обрабатывают стехиометрическим количеством гидроокиси натрия, причем получают раствор мононатриевой соли рифамицина В с рН 4,1. Через 20 дней при комнатной температуре рН раствора доводят до 2,2 путем добавления соляной кислоты, затем экстрагируют этилацетатом. Экстракт упаривают до 50 мл. Неизменившийся кристаллизовавшийся рифамицин В отфильтровывают, фильтрат выливают в 2 л петролейного эфира. Сырой осадок собирают и очищают противоточным делением в аппарате Крэйга (200 трубок), применяя смесь из фосфатного буфера (рН 7,6): бутанола: лигроина 1: 1:

: 0,25. После 170 прохождений максимальная активность обнаруяивается в 160-ой трубке.

Растворитель из 155-ой — 165-ой трубок упаривают досуха; образуется сырой рифамицин S.

В раствор 10 г рифамицина В в смеси

1000 мл метанола и 2000 мл ацетона добавляют раствор 50 г нитрита натрия в 500 мл воды при 0 С. При внешнем охлаждении постепенно добавляют 2500 мл 10О/О-ной водной соляной кислоты, вызывая образование рифамицина О, который выдерживают в растворе в присутствии ацетона. Вследствие сильной кислотности среды рифамицин О постепенно переводится в рифамицин S; преобразование заканчивается через 8 час при 0 — 5 С, Реакционную смесь выливают в большое количество воды и экстрагируют этилацетатом.

Экстракт тщательно промывают водой, концентрируют в вакууме до объема -50 мл и выливают в 500 мл петролейного эфира.

Рифамицин S собирают и выкристаллизовывают из метанола. Выход 6,5 г.

Пример 2, Смесь 13 г рифамицина S, 4,8 r основания Шиффа, полученного путем конденсирования эквимолярных количеств трет.-бутиламина и формальдегида, 1,5 r трет.-бутиламина, 7,2 г двуокиси марганца и

130 мл тетрагидрофурана 6 час кипятят с обратным холодильником. После фильтрации твердого вещества фильтрат выливают в

350 мл этилацетата и 180 мл воды, рН доводят до 7,0 путем добавления разбавленной серной кислоты; органический слой отделяют, промывают, высушивают и концентрируют в вакууме до объема — 100 мл. Затем добавляют 4,3 г 1-амино-4-метил-пиперазина, смесь

2 час выдерживают при комнатной температуре.

Путем разбавления петролейным эфиром осаждают трет.-бутил-аминную соль, из которой общеизвестными способами можно выде лить 3- (4-метил-1-пиперазинилиминометил) °

465795

Составитель С. Щенева

Редактор Н. Спиридонова Техред Е. Подурушина Корректор Н. Лук

Заказ 1517/19 Изд. М 1256 Тираж 529 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

Москва, Я-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2 рифамицин SV с удовлетворительным выходом. Т. пл. 183 — 188 С (с разложением).

Предмет изобретения

Способ получения рифамицина В путем выращивания культуры Streptomyces mediterranei на среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, в аэробных условиях и выделения целевого продукта из фильтрата культуральной жидкости, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения

5 выхода целевого продукта, в качестве продуцента используют штамм АТСС 21789

S tr eptomyces medi terr anei.