Патент ссср 440814

 

О П И С А Н И Е (ii) 4409I4

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

Овва Советских

Социалистических

Республик

К ПАТЕНТУ (61) Зависимый от патента (22) Заявлено 17.05.72 (21) 1785872/30-15 (51) М. Кл. А Olg 7/00

Гос дв ственный комитет (32) Приоритет 18.05.71 (31) 15626/71 (33) Великобритания

Совета Министров СССР бликовано 25.08.74, Вюллстень ¹ 31 (53) УДК 58.002(088.8) Опу па делам изабретений и открытий

Дата опубликования описания 11.06.75 (72) Автор изобретения

Иностранец

Джерри Роберт Даниэль Маккорник (США) Иностранная фирма

«Американ Цианамид Компани» (США) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ХИМИЧЕСКИХ МЕТАБОЛИТОВ

РАСТЕНИЙ

Изобретение относится к получению химических веществ с помощью культивирования тканей растений, погруженных в жидкую аэробную среду, а именно к способу получения химических метаболитов растений, Известен способ, заключающийся в выращивании культуры in vitro изолированных тканей или клеток в контролируемых условиях.

При этом ценные метаболиты растений получают при культивировании целых корневых органов в условиях аэробного погружения в питательную водную среду так же, как и при получении антибиотиков.

Использование известного способа в промышленном масштабе непроизводительно изза трудоемкости его осуществления — возникновения огромной массы растущего нитевидното корневого материала.

Целью изобретения является улучшение условий для накопления метаболитов.

Эта цель достигается тем, что производят редифференциацию растительных ячеек путем снижения ауксин-активности растительных клеток. Снижение уровня ауксин-активности осуществляют разбавлением в соотношении

I: 1 рабочей питательной среды свежей, той же прописи или введения антиауксин-активного соединения.

Способ осуществляют следующим образом.

Метаболиты растений получают суспендированием, при этом происходит процесс генерирования исходного органа растений, что

5 приводит к вырабатыванию метаболитов и понижению уровня ауксин-активности в водной аэробной питательной среде, содержащей растущие недифференцированные клетки клеточных групп названного, растения, погружен10 ного в эту среду, и культивирования первоначального органа растения до тех пор, пока не получают необходимое количество метабол.итов.

Производят инокуляции водной питатель15 ной среды энергично растущими недифференцированными клетками растения, которые вырабатывают метаболиты. Рост недифференцирован ных клеток осуществляют в питательной среде в течение определенного периода

2о времени в условиях аэробного погружения в питательну о среду в присутствии ауксинактивных веществ в этой среде. Затем уров нь ауксин-активных веществ понижают, в результате чего происходит редифференциа25 ция клеток растения на наруж ной части первоначального органа растения при сопутствующей выработке метаболитов. Растущие редифференцированные клетки выдерживают в течение определенного периода времени

440814

Та блица 1

С р е д а

Концентрация, мг/л

Компонент

68

4

0,1

0,4

0,12

0,1

1

1

1

0,06 до 1 л

65 в аэробной среде в погруженном состоянии для получения полностью созревшей массы.

Этот рост приводит к накоплению необходимых количеств метаболитов, которые выделяют и собирают.

Химическими мета болитами растений, которые могут быть получены описанным способом, являются алкалоиды, такие как стрихнин и бруцин из образцов Strychnes; aëêàëoèды раувольфии из образцов Rauwolfia alstonia; винбластин из образцов Catharanthus (главным образом Vinca), антропные алкалоиды из ряда членов семейства Soianaceае, камедь из образцов Be!а vulgaris и . .:11а, красители из образцов Indigofera, Rhus, Beta и Zawsane и т. д.

Для осуществления способа используют водную среду, содержащую один или несколько источников углерода, таких как углеводы или производные жирных кислот, источник ассимилируемого азота, например нитрат-ион или амоний-ион, глицин, мочевину. Предпочтительно применять такие вещества, как глюкоза, сахароза, кукурузный сироп, крахмал, декстрин и другие подобные вещества в качестве источника углерода. Кроме того, питательная среда содержит минеральные соли, например фосфаты, хлориды, сульфаты, металлы (натрий, калий, кальций, магний) и микроэлементы. Микроэлементы обычно присутствуют в виде примесей даже в хорошо очищенных неорганических соединениях.

Кроме того, в .питательную среду вводят один или несколько обычных витаминов: тиамин, рибофлавин, па нтотеновую кислоту и наицин. Эта смесь обеспечивает нормальный рост растительной ткани.

Ауксин-активные вещества — вещества фотогормонального действия, регулирующие рост растений.

Природными ауксинами, т. е. такими, которые обнаруживают активность при регулировании .роста растений и встречаются в целом живущем растении, являются 3-индолуксусная кислота и ее некоторые производные, например, сложные эфиры, гликозиды. Ауксин-активные вещества включают в себя как природные соединения, так и синтетически полученные вещества, обнаруживающие активность, как фитогормональные вещества, промотирующие рост. Ауксин-активные вещества иногда предпочитают в качестве стимуляторов зародышевого развития. Типичные ауксинактивные вещества, применяемые в изобретении, это такие, как 3-индолуксусная кислота, 3-индолмасляная кислота, 1-нафталинуксусная кислота, п-хлорфеноксиуксусная кислота, 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота, 2,4,5-трихлорфеноксиуксусная кислота и т. п.

В способе используют также анти-ауксинные соединения, т. е. такие соединения, которые подавляют или нейтрализуют фитогормональную активность ауксин-активных веществ.

В качестве типичных анти-ауксинов берут, например, 1-нафтоксиуксусную кислоту, коричную кислоту, тропиковую кислоту, 2,3,5трийодбензойную кислоту и 2,4,б-трихлорфеноксиуксусную кислоту.

Пример 1. Индуцирование роста Beta

vulgaris на нормальном растительном материале с сохранением отвержденной среды.

Зерна обычной красной свеклы, Beta vulgaris сорта Detroit Selest clobe, проращивают на влажной фильтровальной бумаге и затем полностью осушают, пророщенные зерна стерилизуют погружением в 1%-íûé раствор гипохлорита на 5 мин. Начиная с этого момента, все операции с живущими тканями проводят при условии полной асептики. Эту рассаду переносят На влажную стерилизованuóþ фнльтровальную бумагу, в виде кружков разрезают на части: радиальные сегменты, hypocotul сегменты и семядольные сегменты, и каждый из этих сегментов переносят в отдельные 1-дюймовые чашки Петри, содержащие по 30 мл среды (табл. 1).

Нитрат калия

Нитрат аммония

Сульфат магния гептагидрат

Хлорид кальция дигидрат

Фосфат калия

Сернистое железо гептагидрат

Сульфат марганца гидрат

Сульфат цинка гептагидрат

Безводная борная кислота

Молибдат аммония

Йодпд калия

Сульфат меди пентагидрат

Сахароза

Агар

Биотип

Холинхлорид

Никотиновая кислота

Ивозитол

Пантотсновая кислота

Пиродоксин

Рибофла вин

Тиамип

2,4-Дихлорфе оксиуксус ая кислота

Квнетин

Дистиллированная вода

Эту среду стерилизуют в автоклаве в течение 20 мин при давлении пара 15 фунт/дюймя (1 фунт/дюйм2 = 0,070307 кгс/см2). Инокули,рованные чашки инкубируют при 25 C и пониженном освещении: после трех недель инкубирования на концах нескольких исходных инокулированных образцов видны крупные наро. сты. Некоторые чашки оказываются испорченными выросшими плесенью или бактериями, их выбрасывают. Наросты, которые появляются на инокулированных чашках переносят в 100 мл емкости, содержащие по

20 мл той же самой агаровой среды, и инку440814

Таблица 2

Среда Концентрация, мг/л

Компонент

220

Таблица 3

Среда

Концентрация, мг/л!

Компонент

68

4

0,1

0,4

0,12

0,1

1,0

1,0

1,0

1,0

1,0

0,06

1,0

65 бирование продолжают еще пять недель при тех же условиях. По истечении этого времени появляется достаточный рост, так что подкультуру можно несколько раз переносить в другие емкости.

Пример 2, Индуцирование неорганизованного роста в жидкой среде и отбор типа, имеющего желательные ростовые свойства.

Из каждой подкультуры в агаре (см. пример 1) отбирают кусочек около 8 мм в диаметре и переносят в склянку Эрленмейера, содержащую 60 мл жидкой среды (состав ее приведен в примере 1, за исключением агара). Эти колбы, содержащие инокулированную жидкую среду, помешают на ротационный встряхиватель, имеющий 120 об/мин и диаметр круга встряхивания 25 мм, и инкубируют при всгряхивапии в диффузном свете в течение четырех недель при 25 С. В конце четвертой недели в разных колбах наблюдаются различные результаты, отражающие степень небрежности при отборе клеток на предыдущей стадии. Некоторые колбы содержат толь <о один большой кусок выроста, в других же имеется один большой и несколько маленьких, очевидно родственной природы, образовавшиеся, по-видимому, как выросты на исходном куске и оторвавшиеся от него в процессе инкубации; в некоторых колбах содержатся разбитые фрагменты, которые сами представляют дальнейшую секретацию клеток.

Те колбы, которые содержат небольшие фрагменты, и те, которые содержат фрагменты с различными особенностями, отбирают для дальнейшей подкультуры и после шести таких операций отбора, переноса и выращивания получают клетки, имеющие желательную скорость роста во встряхиваемых колбах и растущие с образованием простых, непигментированных клеток или маленьких агрегатов, менее чем 0,5 мм в диаметре. Эти. агрегаты при микроскопическом исследовании не обнаруживают никакой тонкой структуры, т. е. другой, чем компоненты клеток. Скорость роста их такова, что при внесении менее 1 клеток в колбу за две недели инкубации на ротационном встряхивателе общий процент образовавшихся клеток составляет 20 об. %.

Эти свойства сохраняются при последующих переносах массы в ту же среду.

Пример 3. Повторный дифференцирован ный рост первичной растительной культуры, погруженной в аэрируемую жидкость.

Содержимому одной из фляжек с диспергированной неорганизованной не пигментированной клеточной культурой Beta vulgaris позволяют отстояться, и чистую жидкость декантируют и отбрасывают. Осевшие клетки и группы клеток дважды промывают по 60 мл за 1 раз с ауксин-свободной жидкой среды (состав среды приведен в примере 1, за исключением 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислогы и агара), и удаляют жидкость декантадией после оседания клеточного материала.

Нитрат калия

Сульфат магния гептагидрат

Хлорид кальция дигидрофосфат

Равные порции промытых клеток затем используют для инокуляции 10 колб Эрленмейера,;аждая из которых содержит 60 мл свободной от ауксина жидкой среды, после чего эти фляжки инкубируют на ротационном встряхивателе, как описано:выше, три недели при 25 С. В течение этого периода инкубации инокулированные клетки и клеточные группы интенсивчо растут и в конце наблюдается редиффсренпиация с образованием пасты из темно-оранжевых или красных частиц, которые при небольшом увеличении микроскопа кажутся состоящими почти целиком из тонких корней исходного растения (первичного), причем каждый из них в изобилии содержит нормальный пигмент, использованный для культивации.

Пример 4. Выделение пигмента.

Отфильтровывают пасту корней первичного из 10 колб предыдущего примера, причем весь питмент содержится в клеточном материале и его нет в отфильтрованной жидкости, которую отбрасывают. Всю массу клеток распределяют в 500 мл воды и смесь кипятят, при этом пигмент переходит в жидкость.

Отфильтровывают и отбрасывают клеточную

Нитрат калия

Сульфат магния гептагидрат

Хлорид кальция дигидрат

Дигидрофосфат калия

Сульфат железа гептагидрат

Сульфат марганца гидрат

Сульфат цинка гептагидрат

Борная кислота

Аммоииймолибдат

Йодид калия

Сульфат меди пеитагидрат

Сахароза

Биотии

И ноз итол (мез о)

Никотииовая кислота

Пантотеиовая кислота

Пиридоксии

Рибофлавии

Тиамии

Кииетии

Холиихлорид

440814

Составитель Л. Плащина

Техред Г. Васильева

Редактор Д. Пинчук

Корректор 3. Тарасова

Заказ 183/16 Изд. № 237 Тираж 565 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

Москва, )К-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2 массу, а полученный красный фильтрат пропускают через 6-дюймовую колонку с катионообменником Dowex 50 2Р, который,задерживает почти весь пигмент, находящийся в жидкости в 2-дюймовом слое вверху колонки. Элюацию пигмента производят 1%-ным раствором бикарбоната натрия, а затем пигмент выделяют при подкислении до рН5, замораживают сухой раствор, и экстрагируют пигмент из замороженного раствора мета иолом. Бетанидин используют в качестве, пищевой краски растительной природы.

Пример 5. Рост недифференциированных клеток в виде диопергированной культуры во встряхиваемой колбе.

Группы клеток приблизительно 8 мм в диаметре с агаровой поверхности используют для инокуляции каждой из пяти колб Эрленмейера, содержащих по 25 мл жидкой среды следующего состава (табл. 2).

Кроме того, среда содержит микроэлементы, сахарозу, витамины, ауксин-активные соединения и цитокины.

После инкубирования в течение 18 дней клеточному материалу дают отстояться, отделяют декантацией жидкость, и промывают

8 осадок 50 мл свежей, свободной от ауксина, среды, следующего состава (табл. 3).

Эту суспензию встряхивают 5 мин, затем снова дают ей возможность осесть и отделя5 ют и отбрасывают чистую отстоявшуюся жидкость. Клеточную массу промывают один раз средой ММ Р по той же методике.

10 Предмет изобретения

1. Способ получения химических метаболитов растений, включающий культуру in vitro, изолированных недифференцированных тканей или клеток в контролируемых условиях, отличающийся тем, что, с целью улучшения условий для накопления метаболитов, производят редифференциацию растительных ячеек путем снижения уровня ауксин-актив20 ности растительных клеток.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что снижение уровня ауксин-актив ности осуществляют разба влением в соотношении 1: 1 рабочей питательной среды свежей, той же

25 прописи или введения антиауксин-активного соединения.