Антимутаген

 

Использование: генетика сельскохозяйственных растений, а именно относится к производным хитозина, обладающим антимутагенной активностью при действии гамма-излучения. Сущность изобретения: созданы новые нетоксичные и биодеградируемые производные хитозина, обладающие высокой антимутагенной активностью при действии гамма-излучением.

Изобретение относится к области генетики сельскохозяйственных растений, в частности к веществам, обладающим антимутагенной активностью при действии гамма-излучения.

Известны производные хитозана, обладающие биологической активностью. В частности, сульфированный хитозан был предложен как аналог гепарина-антикоагулянта крови [1] N,N,N- триметилхитозан проявлял бактерицидную активность [2] При введении бензилпенициллина в молекулу хитозана (путем ковалентного связывания) удалось повысить чувствительность резистентных штаммов и снизить аллергические реакции на этот антибиотик [3] Известны сополимеры, полученные на основе поликатионов диаллильного ряда, обладающие антимутагенной активностью 75,8-90,3% (растительная тест-система семена ячменя, доза гамма-излучения 1500 рад) [4] Однако эти синтетические полимеры не подвергаются биодеградации, что является их существенным недостатком в свете проблем охраны окружающей среды.

Другим недостатком синтетических сополимеров диаллильного ряда является наличие а них определенной токсичности [4] Указанные недостатки устраняются использованием в качестве полимерной матрицы для создания высокоэффективных антимутагенов природного биодеградируемого поликатиона-хитозана [поли-(2-амино-2-деокси-D-глюкоза)] В промышленности хитозан получают путем щелочного гидролиза хитина, извлекаемого из панцирей членистоногих морских животных. Хитин является вторым после целлюлозы по распространенности в природе биополимером.

Существенным достоинством хитозана по сравнению с синтетическими полимерами диаллильного ряда является практически полное отсутствие токсичности [5] Целью изобретения является создание новых производных хитозана, обладающих высокой антимутагенной активностью при действии гамма-излучения.

Указанная цель достигается новыми соединениями, а именно сополимерами, имеющими общую формулу: k:m:n:p (24-83,5):(0-56,5):(1-4):l5,5 [] 2-3,2 дл/г, обладающие антимутагенной активностью при действии гамма-излучения.

Данные соединения получают метилированием технического хитозана, содержащего 15,5% ацетильных групп, йодистым метилом с последующим введением по аминогруппе хитозана остатка феназан-кислоты (ФК) - 3,5-ди-третбутил-4-гидроксифенилпропановая кислота.

Исходный хитозан проявлял антимутагенных активность 40-53% (семена ячменя, доза гамма-излучения 1500 рад).

Полученные новые производные хитозана проявляли антимутагенную активность 77-91% (семена ячменя, доза гамма-излучения 1500 рад).

Увеличение количества ФК-фрагментов -(R) в структуре производных хитозана и звеньев типа "m" авторы считают нецелесообразным, т.к. это может привести к увеличению токсичности [4] Сущность изобретения раскрывается следующими конкретными примерами.

Пример 1. Получение сополимера-производного хитозана-(ПХ-1) состава k:m: n:p=80,5:0:4,0:l5,5 Феназан-кислоту (ФК) марки "ч" в количестве 0,224 r (16,25 10^-4 моль) растворяют в смеси 5 мл хлороформа ("хч") и 0,5 мл диметилформамида ДМФА ("хч"). К полученной смеси добавляют 0,074 г (6,25 10^-4 моль) тионилхлорида ("хч"). Смесь выдерживают в течение 2 ч при 20-25^oС. Полученный раствор добавляют при интенсивном перемешивании к смеси 2 г (0,0125 моль) хитозана (торговое название PRONOVA, производства фирмы Protan, США) и 50 мл хлороформа. Смесь выдерживают в течение 24 ч при 20-25^oС. Осадок отфильтровывают и многократно промывают хлороформом и метанолом для очистки от непрореагировавших веществ и возможных низкомолекулярных примесей. Полученный ПХ-1 для дополнительной очистки переосаждают из раствора в соляной кислоте (0,01% HCl) в ацетон, затем сушат в вакууме при 40-45^oС. Выход ПХ-1 составил 1,21 г (71% от теор.).

Структуру ПХ-1 подтверждают данными элементного анализа и УФ-спектроскопии. Для исходной ФК 8 УФ-спектре характерна отчетливая полоса поглощения в области 240-260 нм, в то время как в УФ-спектре исходного хитозана в сказанном диапазоне полосы поглощения отсутствуют. Наличие в УФ-спектре ПХ-1 полосы поглощения в области 240-260 нм подтверждает появление в структуре хитозана ковалентно-связанных бензольных колец. Полученный ПХ-1 имеет состав k:m:n:p=80,5:0:4,0:l5,5, [h]2-3,2 дл/г.

Элементный состав: Найдено, С 40,21; H 9,30; N 5,81; Сl 11,75
(C₆H₁₂O₄NCl)_80,5 (C₂₃H₃₅O₆N)_4,0 (C₈H₁₃O₅N)_15,5
Вычислено, С 40,46; H 9,15; N 5,82; Cl 11,88
Пример 2. Получение сополимера (ПХ-11) состава k:m:n:p=24,0:56,5:4,0: 15,5
Хитозан в количестве 5 г (0,031 моль), 4 мл йодистого метила ("хч") и 10 мл сухого триэтиламина помещают в стальной реактор объемом 50 мл, герметически закрывают. Реактор помещают в термостат и выдерживают при температуре 46^oC в течение 12 ч. Полученный продукт (А) промывают метанолом и хлороформом.

ФК в количестве 0,448 г (0,0016 моль) растворяют в смеси 5 мл хлороформа и 0,5 мл ДМФА, затем постепенно прибавляют 0,148 г (0,0125 моль) тионилхлорида при температуре 20-25^oС. Полученную смесь выдерживают 2 ч, затем разбавляют 100 мл сухого хлороформа. В полученный раствор помещают продукт (А) и выдерживают 24 ч при температуре 20-25^o С. Осадок отфильтровывают, промывают метанолом для удаления низкомолекулярных примесей и переосаждают из раствора в разбавленной соляной кислоте ( 0,01% HCl) в ацетон, сушат в вакууме при 40-45^oС. Выход ПХ-II 73% от теор. Полупродукт (А) известный N,N,N-триметилхитозан [6]
Структура ПХ-II подтверждена данными элементного анализа и УФ-спектроскопии. Наличие в УФ-спектре полимера полосы поглощения в области 240-260 нм подтверждает появление в структуре сополимера ковалентносвязанных бензольных колец (пример 1). Полученный ПХ-11 имеет состав k:m:n:p=24,0:56,5:4,0:l5,5, [h]2-3,2 дл/г.

Элементный состав:
Найдено, С 45,25; H 5,93; N 6,11; Cl 13,13
(C₆H₁₂O₄NCl)_24,0 (C₉H₁₈O₄NCl)_56,5 (C₂₃H₃₅O₆N)_4,0 (C₈H₁₃O₅N)_15,5
Вычислено, С 45,30; H 5,98; N 6,08; Cl I3,19
Пример 3. Получение сополимера ПХ-111 состава k:m:n:p=83,5:O:1,0:l5,5
Получают сополимер ПХ-III по методике, аналогичной описанной в примере 1, при этом ФК берут в количестве 0,056 r (1,56 10^-4моль), 0,0185 г (1,56 10^-4 моль) тионилхлорида и 2 г (3,125 10^-3моль) хитозана. Выход ПХ-III 69% (от теор.).

Полученный ПХ-Ill имеет состав k:m:n:p=83,5:O:l,O:15,5, [h]2-3,2 дл/г.

Элементный состава:
Найдено, С 40,57; H 6,39; N 7,21; Cl 15,46
(C₆H₁₂O₄NCl)_83,5 (C₂₃H₃₅O₆N)_1,0 (C₈H₁₃O₅N)_15,5
Вычислено, С 40,61; H 6,47; N 7,24; Cl 15,33
Пример 4. Оценка антимутагенной активности сополимеров ПХ на растительной тест-системе.

Влияние ПХ на индукцию гамма-излучением структурных повреждений хромосом у растений оценивали по методу учета хромосомных аберраций в метафазе митоза в меристематических клетках корешков проростков ячменя сорта Московский-121. Использовали дозу гамма-излучения 1500 рад, при которой число клеток с аберрациями хромосом и число аберраций хромосом на клетки увеличивается в 9 раз по сравнению с контролем.

Показано, что ПК по сравнению с исходным хитозаном проявляют более высокую антимутагенную эффективность независимо от последовательности воздействия на семена радиации и протектора.

В первом случае непосредственно после облучения семена помещали в чашки Петри на фильтровальную бумаги, смоченную раствором ПХ в концентрации 250 мг/л на период получения 28-36-часовых проростков и момента их фиксации.

Во втором случае семена до облучения замачивали в течение 3 ч в растворе ПХ при концентрации 250 мг/л, затем облучали, непосредственно после облучения семена отмывали от ПХ и проращивали до фиксации в течение 28-36 ч на фильтровальной бумаге, смоченной отстоявшейся водопроводной водой.

Антимутагенная активность составила для ПХ-I 77,53% для ПХ-II 91,63% для ПХ-III 65,24% что выше, чем у исходного хитозана 40-53%
ФК в концентрациях, соответствующих содержанию этого вещества (в мас.) в пробах тестируемых ПХ не проявлял антимутагенную активность при гамма-излучении.

Таким образом, все предложенные производные хитозана ПХ обладают более высокой антимутагенной активностью 65-91,63% по сравнению с исходным хитозаном 40-53% а по сравнению со структурным аналогом тройными сополимерами диаллильного ряда обладают существенными преимуществами, а именно - биодеградируемостью и отсутствием токсичности.

Источники информации:
1. В.Р. 746.870.

2. Sadagoshi H. Shogo К. "Studies of "macramin" a new high-molecular antibacterial substance derived from chitin". Jap.med.J. 1950, 3, 119-125.

3. B.P. 1.038.367
4. Патент N 2043368, опубл. 10.09.95, Бюл. N 25.

5. Edgar S. Lower. Manufacturing chemist, 1984, 10, 47-52.

6. Нудьга Л. А. Плиско Е.А. Данилов С.Н. N-алкилирование хитозана. Ж. общ. хим. 1973, 43(12), 2756-60.

Формула изобретения

Антимутаген, содержащий производные хитозана, отличающийся тем, что в качестве производных используются полимеры ряда хитозана общей формулы, приведенной ниже

при соотношении k m n p (24 83,5) (0 56,5) (1 4) 15,5, где R -
.