Способ выделения природных антимикробных пептидов из лейкоцитарно-эритроцитарно-тромбоцитарной массы крови

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к выделению природных антимикробных пептидов.

Известно, что антимикробные пептиды (АМП) являются одними из ключевых молекул врожденного иммунитета, обеспечивающих противоинфекционную защиту организма. Кроме антимикробного действия, АМП проявляют широкий спектр других биологических эффектов, что дает основание их причислить к биомодуляторным соединениям. АМП участвуют в процессах ранозаживления, способны связывать эндотоксины и проявлять противоопухолевое действие. В этой связи АМП являются перспективными молекулами-прототипами для создания новых лекарственных препаратов (Suarez-Carmona М., 2015; М.Е., 2017).

Однако основным недостатком является: высокая стоимость рекомбинантного синтеза АМП для полномасштабного производства конечного продукта.

Наиболее близким к предлагаемому техническому решению является «Способ выделения низкомолекулярных пептидов» (Патент РФ №2510398).

В данном способе в качестве сырья используют эритромассу крови доноров. Отобранная для переработки эритромасса должна пройти вирусологический контроль. Гидролизат получают ферментативным гидролизом предварительно гемолизированной эритромассы крови доноров с 2% пепсина от исходного объема в течение 144 ч и с коррекцией среды (0,01-0,1) М раствором соляной кислоты до рН (1,5-2,0), инактивируют фермент, осветляют гидролизат раствором перекиси водорода с конечной концентрацией 0,83% с последующим выдерживанием при 66°С в течение 15 мин и осаждают балластные вещества методом центрифугирования при 3000 об/мин в течение 15 мин. Полученную жидкую фракцию низкомолекулярных пептидов подвергают стерилизующей фильтрации через мелкопористые фильтры с диаметром пор 0,2 мкм. Определение молекулярной массы пептидов в гидролизате проводят методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). С 1 л исходного сырья эритромассы получают (100-110) г сухого вещества, что соответствует содержанию аминного азота (390-430) мг %, представленного низкомолекулярными пептидами и аминокислотами.

Однако в данном способе выделения низкомолекулярных пептидов используют эритромассу, содержащую недостаточное количество антибактериальных пептидов. Для осаждения Сефадекса G-25 используют центрифугирование. Сефадекс G-25 обладает высокой селективностью по молекулярной массе и способен удерживать большой спектр пептидов с молекулярной массой от 1 до 5 кДа. Это приводит к удалению большей части низкомолекулярных пептидов с другой молекулярной массой вместе с надосадочной жидкостью после центрифугирования, снижая тем самым биологическую ценность гидролизата. При удалении осадка после центрифугирования происходит значительный расход дорогостоящего Сефадекса G-25. На заключительном этапе используется ВЭЖХ только для количественного определения низкомолекулярных пептидов с неидентифицированной биологической ценностью для косметических и лекарственных композиций.

Поставлена задача оптимизации выделения наиболее полной фракции природных низкомолекулярных пептидов, содержащих антимикробные пептиды с повышенной биологической ценностью и снижения себестоимости ее получения для дальнейшего создания фармацевтических композиций.

Поставленная задача достигается ферментативным гидролизом лейкоцитарно-эритроцитарно-тромбоцитарной массы крови,

предварительно подверженной гемолизу, вирусинактивации, осветлению раствором перекиси водорода с конечной концентрацией 0,6%, выдерживанием 15 минут при 66°С, осаждением балластных веществ центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 минут, с дальнейшей стерилизующей фильтрацией через мелкопористые фильтры с диаметром пор 0,2 мкм, и получением фракции пептидов при использовании разделительной колонки с Сефадексом G-25.

Отличительные признаки заявляемого технического решения от известного - использование в качестве исходного сырья лейкоцитарно-эритроцитарно-тромбоцитарной массы крови, трехкратное применение разделительной колонки с Сефадексом G-25, что позволяет оптимизировать технологию выделения наиболее полной фракции природных низкомолекулярных пептидов, содержащих АМП, повысить их биологическую ценность.

Способ осуществляют следующим образом.

В качестве сырья используют лейкоцитарно-эритроцитарно-тромбоцитарную массу крови. Отобранная для переработки лейкоцитарно-эритроцитарно-тромбоцитарная масса проходит вирусологический

контроль (на отсутствие HBS-антигена к вирусу гепатита В, антител к вирусу гепатита С и ВИЧ), рН (6,81±0,23), содержание аминного азота (249,90±36,35) мг %.

Гидролизат получают ферментативным гидролизом с использованием 10 мл раствора трипсина на 100 мл гидролизуемой смеси в течение 1 часа в растворе «Версена». Гидролизат осветляют раствором перекиси водорода с конечной концентрацией 0,6%. Полученный гидролизат пропускают через разделительную колонку, на дне которой находится мелкопористый фильтр с диаметром пор 0,2 мкм и 30 г Сефадекса G-25. Первую фракцию удаляют. Через набухший гель пропускают раствор «Версена». Отбирают пробу с максимальным содержанием антибактериальных пептидов. Для определения максимальной концентрации антибактериальных пептидов в полученных образцах проб, используют метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Для построения калибровочной кривой используют стандарт дефензина-альфа 1 из наборов Cloud-Clone Corp. (США).

На фигуре 1 представлен калибровочный график концентраций АМП (дефензин-альфа 1), где по оси абсцисс указана концентрация АМП, а по оси ординат - площадь пика.

Полученную фракцию еще раз стерилизуют фильтрацией через мелкопористые фильтры с диаметром пор 0,2 мкм.

На фигуре 2 представлена хроматограмма фракции АМП, полученная без использования разделительной колонки.

По оси абсцисс указано время измерения в минутах, а по оси ординат оптическая плотность (mAU), где 1-пик фракции дефензина альфа, а 2,3,4-пики фракции других дефензинов в остаточном количестве. Помимо дефензина альфа, и другие виды дефензинов в остаточном количестве, представленные в таблице 1.

Далее полученные пептиды подвергают лиофильному высушиванию.

На фигуре 3 представлена хроматограмма фракции АМП после промывки, регенерации и высушивания при использовании разделительной колонки без дополнительной замены Сефадекса G-25.

По оси абсцисс указано время измерения в минутах, а по оси ординат-оптическая плотность.

В таблице 2 отображены данные хроматограммы после промывки.

Предлагаемый способ обеспечивает получение фракции, содержащей антимикробные пептиды с концентрацией 0,335 мкг/мл,

Полученные результаты показывают, что использование в качестве исходного сырья лейкоцитарно - эритроцитарно - тромбоцитарной массы и разделительной колонки с Сефадексом G-25, позволяет оптимизировать технологию выделения наиболее полной фракции естественных низкомолекулярных пептидов, содержащих АМП, несколько раз использовать Сефадекс G-25 после промывки, регенерации и высушивания, повысить их биологическую ценность, снизить себестоимость их получения, для дальнейшего создания фармацевтических композиций.

Способ выделения природных антимикробных пептидов из лейкоцитарно-эритроцитарно-тромбоцитарной массы крови, содержащий ферментативный гидролиз исходного сырья, пропускание через разделительную колонку с Сефадексом G-25, последующую стерилизующую фильтрацию полученной субстанции через мелкопористые фильтры с диаметром пор 0,2 мкм, отличающийся тем, что используют лейкоцитарно-эритроцитарно-тромбоцитарную массу крови, предварительно подверженную гемолизу трипсином, а выделение антимикробных пептидов проводят методом жидкостной хроматографии на разделительной колонке с трехкратным использованием Сефадекса G-25.