Способ перкутанной аспирационной пункционной биопсии печени у крыс

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии, может быть использовано как способ получения биоптата у крыс для оценки стадии развития фиброза печени.

Впервые выполненная в 1884 году П. Эрлихом пункционная биопсия печени до настоящего времени остается «золотым стандартом» диагностики в изучении заболеваний печени.

Известен способ перкутанной аспирационной пункционной биопсии печени у крыс с использованием набора для пункционной биопсии по методу Menghini, заключающийся в применении доступа через брюшную стенку [1, 2]. Данный способ принят за аналог. При этом авторы утверждают, что «из-за анатомических особенностей крысы типичный межреберный доступ нельзя использовать» в связи с высокой вероятностью повреждения диафрагмы [1]. Этот доступ имеет и другие существенные недостатки: во-первых, прохождение пункционной иглой через брюшную стенку крайне затруднено по причине высокой подвижности мышц и слабой их фиксации к скелетному каркасу; во-вторых, высокая вероятность получения биоптата другой ткани в результате прокола пункционной иглой других органов; в-третьих, высокий риск летальных исходов экспериментальных животных в результате повреждения жизненно важных органов (легкие, брюшной отдел аорты, кишечник, желудок), связанный со случайным проколом печени насквозь в процессе прохождения пункционной иглой через брюшную стенку. Перечисленные факторы существенно затрудняют выполнение данной манипуляции.

Целью изобретения является повышение точности, эффективности и безопасности выполнения пункционной биопсии печени у экспериментальных крыс.

Поставленная цель реализуется в способе перкутанной аспирационной пункционной биопсии печени у крыс, в котором после предоперационной подготовки пальпаторно определяют мечевидный отросток и край правой реберной дуги, при помощи скальпеля с градуированной линейкой откладывают интервал 2 см от нижнего края мечевидного отростка в сторону правой области грудной клетки до точки D, затем выполняют разрез кожи скальпелем от вышеуказанной точки D в сторону реберной дуги по направлению к мечевидному отростку; затем определяют точку пункции (Р), которая находится на расстоянии 0,5 см от точки D в сторону края реберной дуги на протяжении разреза и соответствует межреберью VII и VIII ребра; затем при помощи троакара размером 1,6 мм в точке Р осуществляют прокол под прямым углом по направлению к нижнему краю мечевидного отростка до ощущения провала в брюшную полость; после этого троакар извлекают и используют пункционную иглу размером 18 G, которую вводят в пункционный канал до ощущения провала в брюшную полость; к пункционной игле присоединяют аспирационный шприц, в который предварительно набирают 5 мл физиологического раствора; предпосылая иглу перпендикулярно грудной клетке и смещая ее вправо на 10 градусов, осуществляют прокол капсулы печени на глубину приблизительно 1 см, при этом одновременно с проколом выполняют аспирацию поршнем шприца до защелки фиксатора; затем, не извлекая иглу из печени, отклоняют ее на 20-30 градусов относительно оси прокола, после чего возвращают иглу в прежнее положение и извлекают из пункционного канала.

Изобретение поясняется фиг. 1, на которой показана фиксация крысы на операционном столе; фиг. 2, на которой показано определение точки D; фиг. 3, на которой показано рассечение кожи скальпелем; фиг. 4, на которой показано топографическое расположение пункционной иглы в проекции межреберья VII и VIII ребра; фиг. 5, на которой показано использование точки Р для исключения вероятности повреждения диафрагмы; фиг. 6, на которой показана подготовка пункционного канала; фиг. 7, на которой показан прокол капсулы печени; фиг. 8, на которой показана аспирация биоптата и отделение его от основной ткани; фиг. 9-10, на которой приведен вид биоптата печени; фиг. 11, на которой показан гистологический препарат образца ткани печени, полученного при пункционной биопсии, окр. гематоксилином-эозином, ув. ^×50. На фиг. 12. показано формирование нежных неваскуляризированных порто-портальных соединительно-тканных септ. Окр. гематоксилином-эозином, ув. ^×100. На фиг. 13 показано формирование нежных неваскуляризированных порто-портальных соединительно-тканных септ. Окр. пикрофуксином по Ван Гизон, ув. ^×100.

Метод реализуется следующим образом.

Крысам породы Wistar весом 250±50 г в условиях операционной, вводится общий анестетик диссоциативного действия Zoletil 100 (по 250 мг тилетамина гидрохлорида и золепама гидрохлорида) в дозе 20 мг/кг веса. После наступления анестезии у животного сбривается шерсть в области брюшка и грудной клетки справа, после чего осуществляется фиксация на операционном столе (фиг. 1).

Операционное поле обрабатывается антисептическим раствором по Филончикову-Гроссиху. Пальпаторно определяется мечевидный отросток и край правой реберной дуги. При помощи скальпеля с градуированной линейкой откладывается интервал 2 см от нижнего края мечевидного отростка в сторону правой области грудной клетки. Полученная точка D соответствует месту прикрепления диафрагмы к грудной клетке (фиг. 2).

Далее выполняется разрез кожи скальпелем от точки D в сторону реберной дуги по направлению к мечевидному отростку (фиг. 3).

Затем происходит определение точки пункции (Р), которая находится на расстоянии 0,5 см от точки D в сторону края реберной дуги на протяжении разреза и соответствует межреберью VII и VIII ребра (фиг. 4).

Используя точку Р, мы исключаем вероятность повреждения диафрагмы (фиг. 5).

При помощи троакара размером 1,6 мм в точке Р осуществляется прокол под прямым углом по направлению к нижнему краю мечевидного отростка до ощущения провала в брюшную полость. Данная манипуляция выполняется с целью подготовки канала для прохождения по нему пункционной иглы (фиг. 6).

После этого троакар извлекается и используется пункционная игла размером 18 G из набора для пункции печени тип Menghini, которая вводится в пункционный канал до ощущения провала в брюшную полость.

К пункционной игле присоединяется аспирационный шприц, в который предварительно набирается 5 мл физиологического раствора. Предпосылая иглу перпендикулярно грудной клетке и смещая ее вправо на 10 градусов, осуществляется прокол капсулы печени на глубину приблизительно 1 см при этом одновременно с проколом выполняется аспирация поршнем шприца до защелки фиксатора (фиг. 7).

Для отделения биоптата от основной ткани, необходимо, не извлекая иглу из печени, отклонить ее на 20-30 градусов относительно оси прокола, после чего вернуть иглу в прежнее положение. Игла извлекается из пункционного канала (фиг. 8).

Полученный биоптат под давлением, создаваемым поршнем в шприце, выдавливается из иглы, после чего помещается в пробирку с формалином (фиг. 9-10).

Края раны ушиваются с использованием рассасывающегося шовного материала, после чего обрабатываются 5% спиртовым раствором йода

С целью профилактики кровотечений крысе однократно вводится 0,1 мл 12,5% этамзилата, после чего животное укладывается животом на предварительно обернутый пеленкой пузырь со льдом на 20-30 минут. На завершающем этапе процедуры животное помещается в чистую клетку. Обработка операционного шва 5% спиртовым раствором йода выполняется один раз в сутки на протяжении 4 дней.

Для объективной оценки эффективности пункционной биопсии печени использовался гистологический метод. Образцы биоптата помещались в раствор 10% нейтрального формалина, в котором фиксировались в течение 24 часов. После фиксации образцы подвергались дегидратации путем инкубации в изопропиловых спиртах, имбибировались парафином по общепринятой методике. Из парафиновых блоков с помощью ротационного микротома изготавливались срезы ткани толщиной 4 мкм, окрашивались гематоксилином-эозином и пикрофуксином по Ван Гизон и заключались по покровные стекла (см. фиг. 11-13). Изучение гистологических препаратов осуществлялось с помощью бинокулярного микроскопа в проходящем свете при суммарном увеличении ^×50, ^×100, ^×200, ^×400. Полуколичественная оценка степени выраженности фиброза определялась по системе METAVIR [3] (где F0 -отсутствие фиброза, F1 - звездчатое расширение портальных трактов без образования септ, F2 - расширение портальных трактов с редкими порто-портальными септами, F3 - множественные порто-центральные септы без цирроза, F4 - цирроз).

Преимущества использования предложенного метода подтверждается следующими фактами. При гистологическом исследовании материала, полученного от 30 крыс породы Wistar с использованием данного доступа, в 30 случаях (100%) определялись портальные тракты печени, позволяющие определить стадию фиброза печени. Летальные исходы у лабораторных животных зарегистрированы не были. Это дает возможность оценить динамику наступления фибротических изменений в печени у одного и того же животного.

Список литературы

1. Corbin, I.R. Serial percutaneous liver biopsies in laboratory rats / I.R. Corbin, G.Y. Minuk // Dig. Dis. Sci. - 2003. - V. 48. - №10. - P. 1939-1943.

2. Drews, G. Percutaneous liver core biopsy in rats: an alternative to minilaparotomy / G. Drews [et al.] // J. Exp. Anim. Sci. - 2000. - №41. - P. 115-120.

3. Bedossa, P. An algorithm for the grading of activity in chronic hepatitis С / P. Bedossa, T. Poynard; The METAVIR Cooperative Study Group // Hepatology. - 1996. - №24. - P. 289-293.

Способ перкутанной аспирационной пункционной биопсии печени у крыс, отличающийся тем, что после предоперационной подготовки пальпаторно определяют мечевидный отросток и край правой реберной дуги, при помощи скальпеля с градуированной линейкой откладывают интервал 2 см от нижнего края мечевидного отростка в сторону правой области грудной клетки - точка D, затем выполняют разрез кожи скальпелем от точки D в сторону реберной дуги по направлению к мечевидному отростку; после чего определяют точку пункции Р, которая находится на расстоянии 0,5 см от точки D в сторону края реберной дуги на протяжении разреза и соответствует межреберью VII и VIII ребра; далее при помощи троакара размером 1,6 мм в сагиттальной плоскости, проходящей через точку Р под углом 45 градусов в направлении к нижнему краю мечевидного отростка, осуществляют прокол на глубину 3-5 мм до ощущения провала в брюшную полость; после этого троакар извлекают и используют пункционную иглу размером 18 G, которую вводят в пункционный канал до ощущения провала в брюшную полость; к пункционной игле присоединяют аспирационный шприц, в который предварительно набирают 5 мл физиологического раствора; предпосылая иглу перпендикулярно грудной клетке и смещая ее вправо на 10 градусов, осуществляют прокол капсулы печени на глубину приблизительно 1 см, при этом одновременно с проколом выполняют аспирацию поршнем шприца до защелки фиксатора; затем, не извлекая иглу из печени, отклоняют ее на 20-30 градусов относительно оси прокола, после чего возвращают иглу в прежнее положение и извлекают из пункционного канала.