Способ размножения гречихи in vitro
Владельцы патента RU 2538167:
ГОСУДАРСТВЕННОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ПРИМОРСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК (ГНУ ПРИМОРСКИЙ НИИСХ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ) (RU)
Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии. Изобретение представляет собой способ размножения гречихи in vitro, включающий размножение гречихи из асептических проростков семян. Семена предварительно стерилизуют концентрированной серной кислотой и культивируют на среде Мурасиге и Скуга без фитогормонов. Субкультивируют, используя верхнюю часть побега проростка с пазушной почкой с получением микрорастений на питательной среде Мурасиге и Скуга с фитогормонами с содержанием сернокислой меди в количестве от 9,2 до 23,0 мг/л, которые делят на черенки, культивируют, субкультивируют и укореняют на этой среде. Использование заявленного способа позволяет повысить эффективность процесса размножения микрорастений гречихи в условиях in vitro за счет его упрощения, ускорения, снижения затрат и увеличения выхода пробирочных растений. 3 табл.
Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к селекции растений и сельскохозяйственной биотехнологии, и может быть использовано в селекции и семеноводстве растений, в частности для ускорения процесса размножения ценных форм, регенерантов и сортов гречихи, а также в исследованиях по генетике и физиологии растений.
Известен способ размножения гречихи in vitro, включающий вычленение эксплантов, их культивирование с получением первичной каллусной ткани, индукцию органогенеза и получение растений-регенерантов (см., например, авторское свидетельство СССР №1704715, МПК5 A01H 4/00, 1992 г.).
Недостатком этого способа размножения гречихи in vitro является:
- трудоемкость вычленения недозрелых зародышей;
- сложность отбора зародышей требуемого размера от 0,5 до 3,0 мм для культивирования;
- удлинение процесса размножения растений гречихи in vitro из-за наличия этапа получения первичной каллусной ткани;
Известен также способ размножения гречихи in vitro, в котором в качестве эксплантов используют узлы растений, а культивирование и субкультивирование осуществляют на одной и той же модифицированной питательной среде Гамборга В5, в которую дополнительно вносят 6-БАП в количестве 5-10 мг/л и 1-2 мг/л (см., например, авторское свидетельство СССР №1658928, МПК5 A01H 4/00, 1991 г.).
Недостатком данного способа размножения гречихи in vitro является:
- низкая эффективность получения стерильных растений, так как для стерилизации растительных тканей более сложно подобрать дезинфицирующие средства, чтобы сохранить ткани живыми и способными к регенерации, чем для семян;
- снижение коэффициента размножения после добавления в питательную среду фитогормона 6-БАП, вследствие появления аномальных форм побегов с нехарактерной морфологией, а также раннего цветения микрорастений гречихи.
Наиболее близким к заявляемому изобретению является способ размножения гречихи in vitro, включающий вычленение эксплантов в качестве которых используют участки недельных асептических проростков, их культивирование с получением первичной каллусной ткани, индукцию органогенеза и получение растений-регенерантов (см., например, патент на изобретение №2229219, МПК7 A01H 4/00, C12N 5/00, A01H 1/04, 2004 г.).
Недостатком известного прототипа является:
- увеличение времени на получение растений гречихи в процессе регенерации из каллуса, так как сначала надо индуцировать образование первичной каллусной ткани;
- снижение частоты регенерации побегов из каллуса по сравнению с прямым органогенезом;
- снижение выхода растений идентичных исходному генотипу при регенерации из каллусной ткани вследствие проявления сомаклональной изменчивости.
Цель изобретения - повысить эффективность процесса размножения микрорастений гречихи в условиях in vitro за счет его упрощения, ускорения, снижения затрат и увеличения выхода пробирочных растений.
Указанная цель достигается тем, что способ размножения гречихи in vitro, включающий размножение гречихи из асептических проростков семян, отличающийся тем, что семена предварительно стерилизуют концентрированной серной кислотой и культивируют на среде Мурасиге и Скуга без фитогормонов с получением асептических проростков, субкультивируют, используя верхнюю часть побега проростка с пазушной почкой с получением микрорастений на питательной среде Мурасиге и Скуга с фитогормонами с содержанием сернокислой меди в количестве от 9,2 до 23,0 мг/л, которые делят на черенки, культивируют, субкультивируют и укореняют на этой среде.
По сравнению с прототипом признаками изобретательского уровня предлагаемого способа размножения гречихи in vitro являются:
1 «…семена предварительно стерилизуют концентрированной серной кислотой и культивируют на среде Мурасиге и Скуга без фитогормонов с получением асептических проростков…», что позволяет:
- значительно упростить процедуру стерилизации семян из-за сокращения времени ее проведения, так как обработку концентрированной серной кислотой проводят однократно в течение 2 минут;
- значительно ускорить снятие плотной околоплодной оболочки и быстрее пассировать плоды на питательные среды за счет того, что после погружения семян гречихи в серную кислоту происходит частичное разрушение (размягчение) околоплодной оболочки;
- снизить затраты на приобретение дорогостоящих фитогормонов за счет получения асептических проростков из семян на среде Мурасиге и Скуга без фитогормонов, так как на этом этапе еще идет выбраковка части инфицированного материала.
2 «…субкультивируют, используя верхнюю часть побега проростка с пазушной почкой с получением микрорастений на питательной среде Мурасиге и Скуга с фитогормонами с содержанием сернокислой меди в количестве от 9,2 до 23,0 мг/л, которые делят на черенки, культивируют, субкультивируют и укореняют на этой среде», что позволяет:
- увеличить выход активно растущих микрорастений за счет использования верхней части побега с пазушной почкой;
- увеличить выход пробирочных растений гречихи за три пассажа в 1,9 раз;
- ускорить размножение ценных форм и сортов гречихи;
- максимально снизить появление микрорастений с аномальной морфологией, так как 6-БАП не используется, и получать идентичные исходному генотипу микрорастения с нормальной морфологией;
- повысить эффективность и упростить процесс микроразмножения при культивировании и субкультивировании черенков гречихи за счет применения питательной среды одного состава, которая обеспечивает одновременно рост микрорастений и их укоренение;
- снизить затраты на культивирование микрорастений в условиях in vitro за счет сокращения сроков размножения материала до необходимого объема, ускорить производство семян.
Признаки, указанные в отличительной части описания достижения цели доказывают, что заявляемый способ размножения гречихи in vitro обладает новизной. Совокупность признаков, приведенных в сравнении свойств заявляемого и известного решения, дает основание сделать вывод, что заявляемый способ имеет изобретательский уровень.
Предлагаемый способ размножения гречихи in vitro осуществляется следующим образом. Зрелые семена гречихи стерилизуют, погружая на две минуты в концентрированную серную кислоту. В таблице 1 представлены результаты эксперимента по эффективности стерилизации семян гречихи хлорсодержащим дезинфицирующим агентом раствором хлорамина Б в сравнении с предлагаемым способом стерилизации концентрированной серной кислотой. Результаты свидетельствуют о существенном повышении эффективности процесса стерилизации семян концентрированной серной кислотой, так как процент освобожденных от инфекции семян составил от 71,0 до 100.
Семена, прошедшие стерилизацию серной кислотой, трижды промывают в течение 5-10 минут стерильной дистиллированной водой, освобождают от перикарпия (плодовой оболочки) и пассируют на питательную среду Мурасиге и Скуга без фитогормонов, содержащую следующие
Таблица 1 | |||||
Эффективность различных способов стерилизации семян гречихи | |||||
№ п/п | Сорт, гибрид | 70% раствором этанола и 10% раствором хлорамина Б | концентрированной серной кислотой | ||
1 | 2 | 1 | 2 | ||
1 | Приморская 7 | 47 | 38,3 | 31 | 71,0 |
5 | Приморская местная | 31 | 13,0 | 30 | 100 |
6 | Изумруд x Наташа | 36 | 0 | 25 | 76,0 |
8 | Приморская местная | 31 | 13,0 | 30 | 100 |
Примечание: | |||||
- обработано семян, шт.; 2 - эффективность стерилизации, %. |
компоненты (в мг/л): тиамин-НСl - 2,0; пиридоксин-НСl - 1,0; гидролизат казеина - 1000,0; сахароза - 20000; агар микробиологический - 6000 при pH от 5,6 до 6,0. Культивирование проводят в пробирках с ватно-марлевыми пробками до получения асептических проростков в контролируемых условиях: 16-часовой фотопериод, интенсивность освещения 4-5 тысяч люкс, температура 23±2°C.
При появлении из зоны семядольного узла асептического проростка растущего побега, отделяют его верхнюю часть (примерно длиной 10-20 мм) и помещают на питательную среду, включающую следующие компоненты (в мг/л):
Аммоний азотнокислый (NH4NO3) - 1650
Калий азотнокислый (KNO3) - 1900
Калий фосфорнокислый однозамещенный (KH2PO4) - 170
Магний сернокислый семиводный (MgSO4×7H2O) - 370
Кальций хлористый двухводный (CaCl2×2H2O) - 440
Железо сернокислое семиводное (FeSO4×7H2O) - 27,8
Трилон Б (Na2ЭДТА×2H2O) - 37,3
Борная кислота (H3BO3) - 6,2
Марганец сернокислый четырехводный (MnSO4×4H2O) - 22,3
Кобальт хлористый шестиводный (CoCl2×6H2O) - 0,025
Медь сернокислая пятиводная (CuSO4×5H2O) - от 9,2 до 23,0
Цинк сернокислый семиводный (ZnSO4×7H2O) - 8,6
Натрий молибденовокислый двухводный (NaMoO4×2H2O) - 0,25
Калий йодистый (KI) - 0,83
Тиамин-HCl - 2,0
Пиридоксин-HCl - 1,0
Гидролизат казеина - 1000,0
ИУК (индолил-3-уксусная кислота) - 0,5
ИМК (3-индолилмасляная кислота) - 0,2
Сахароза - 20000
Агар микробиологический - 6000
при pH от 5,6-6,0.
В таблице 2 приведены результаты испытания пяти вариантов питательных сред, среди которых среда Барсукова Е.Н. использована как наиболее близкий прототип (патент на изобретение №2229219, МПК7 A01H 4/00, C12N 5/00, A01H 1/04, 2004 г.).
Таблица 2 | |||||
Коэффициент размножения микроклонов гречихи на питательных средах различного состава | |||||
Вариант среды | Среднее количество микрорастений, шт. | Выход растений за три пассажа, шт. | |||
I пассаж* | II пассаж | III пассаж | Среднее за три пассажа | ||
Bohanec В., 6-БАП 1,0 мг/л, ИУК 0,5 мг/л | 1,2 | 2,6 | 1,9 | 1,9 | 6,86 |
Суворова Г.Н., 6-БАП 2,25 мг/л, ИУК 0,2 мг/л | 1,1 | 1,5 | 0,4 | 1,0 | 1,0 |
Барсукова Е.Н., ИУК 0,5 мг/л, ИМК 0,2 мг/л | 2,0 | 2,8 | 2,8 | 2,5 | 15,63 |
БТМ1, ИУК 0,5 мг/л, ИМК 0,2 мг/л, 23,0 мг/л CuSO4×5H2O | 2,6 | 3,3 | 3,4 | 3,1 | 29,79 |
БТМ2 ИУК 0,5 мг/л, ИМК 0,2 мг/л; 69,0 мг/л CuSO4×5H2O | 1,1 | 1,3 | 0 | 0,8 | 0,51 |
Среднее по опыту | 1,6 | 2,3 | 1,7 | 1,9 | 6,86 |
Примечание - * пассаж составляет 25-30 дней |
Максимальное количество растений за три пассажа получено 29,79 штук при культивирования на среде БТМ1, содержащей наряду с фитогормонами ИУК 0,5 мг/л, ИМК 0,2 мг/л дополнительно 23,0 мг/л CuSO4×5H2O.
Оптимальное для микроразмножения гречихи в условиях in vitro содержание в питательной среде сернокислой меди установлено экспериментально и приведено в таблице 3.
Таблица 3 | ||||||
Коэффициент размножения микроклонов гречихи на питательных средах с различным содержанием сернокислой меди | ||||||
№ п/п | Вариант среды (содержание сернокислой меди, мг/л) | Количество микрорастений, шт. | Выход растений за три пассажа, шт. |
|||
I пассаж* | II пассаж | III пассаж | среднее за три пассажа | |||
1 | контроль 0,025 | 1,8±0,13 | 2,4±0,16 | 2,3±0,30 | 2,1±0,12 | 9,3 |
2 | 4,625 | 1,8±0,13 | 2,6±0,33 | 2,6±0,33 | 2,3±0,17 | 12,2 |
3 | 9,225 | 2,3±0,15 | 2,7±0,30 | 2,8±0,29 | 2,6±0,14 | 17,6 |
4 | 13,825 | 2,3±0,21 | 2,7±0,26 | 2,8±0,20 | 2,6±0,13 | 17,6 |
5 | 18,425 | 1,6±0,22 | 3,0±0,21 | 3,2±0,20 | 2,6±0,17 | 17,6 |
6 | 23,025 | 2,0±0,14 | 2,6±0,16 | 2,9±0,23 | 2,5±0,12 | 15,6 |
7 | 27,625 | 1,5±0,16 | 2,7±0,21 | 2,5±0,16 | 2,2±0,13 | 10,6 |
8 | 32,225 | 1,5±0,16 | 2,3±0,23 | 1,8±0,35 | 1,8±0,15 | 5,8 |
9 | 36,825 | 1,6±0,49 | 2,1±0,23 | 1,8±0,20 | 1,8±0,19 | 5,8 |
10 | 41,425 | 1,0±0,13 | 2,1±0,23 | 1,9±0,17 | 1,6±0,13 | 4,1 |
11 | 46,025 | 1,25±0,16 | 1,8±0,20 | 1,7±0,33 | 1,6±0,14 | 4,1 |
HCP05 | 0,4 | 5,4 | ||||
Примечание: *пассаж составляет 25-30 дней |
В качестве контроля использовали среду Барсукова Е.Н., ИУК 0,5 мг/л, ИМК 0,2 мг/л (патент на изобретение №2229219, МПК7 A01H 4/00, C12N 5/00, A01H 1/04, 2004 г.) со стандартным для минеральной основы по Мурасиге и Скугу содержанием меди сернокислой пятиводной - 0,025 мг/л. Добавление в питательную среду сернокислой меди в количестве от 9,2 до 23,0 мг/л статистически достоверно увеличило выход растений гречихи за три пассажа от 15,6 до 17,6 шт., что в 1,7-1,9 раза больше, чем на контрольной среде (табл.3).
Полученные микрорастения делят на черенки с пазушной почкой, культивируют, субкультивируют и укореняют на питательной среде одного состава, который приведен выше, с содержанием меди сернокислой пятиводной от 9,2 до 23,0 мг/л.
Условия культивирования асептических проростков, черенков и микрорастений аналогичны. Для получения семян укорененные растения гречихи из пробирок высаживают в почву.
Применение предлагаемого изобретения позволит повысить эффективность процесса размножения гречихи в условиях in vitro, значительно упростить и ускорить его, снизить затраты и существенно увеличить выход пробирочных растений.
Способ размножения гречихи in vitro, включающий размножение гречихи из асептических проростков семян, отличающийся тем, что семена предварительно стерилизуют концентрированной серной кислотой и культивируют на среде Мурасиге и Скуга без фитогормонов с получением асептических проростков, субкультивируют, используя верхнюю часть побега проростка с пазушной почкой с получением микрорастений на питательной среде Мурасиге и Скуга с фитогормонами с содержанием сернокислой меди в количестве от 9,2 до 23,0 мг/л, которые делят на черенки, культивируют, субкультивируют и укореняют на этой среде.