Способ регенерации микропобегов hyssopus officinalis l. в условиях in vitro
Владельцы патента RU 2529837:
НИКИТСКИЙ БОТАНИЧЕСКИЙ САД - НАЦИОНАЛЬНЫЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР (RU)
Способ регенерации адвентивных микропобегов Hyssopus officinalis L. в условиях in vitro включает отделение листьевых дисков от микропобегов после 4-5 пассажа, полученных в культуре in vitro, дальнейшее культивирование их на модифицированной питательной среде Мурасиге и Скуга с половинной концентрацией макроэлементов и дополненной веществом цитокининового типа действия, а именно тидиазуроном, при этом культивирование проводят при пониженной интенсивности освещения. 4 табл.
Изобретение относится к биотехнологии получения посадочного материала и может быть использовано для быстрого размножения, селекции и генетических манипуляций иссопа (Hyssopus officinalis L.) в условиях in vitro.
Известен способ получения микропобегов H.officinalis в культуре in vitro с использованием вегетативных почек Lt C.L. Multiplication in vitro de I'Husope (Hyssopus officinalis L.) // Revue Suisse de Vitic. Arboric. Hortic. - 1987.-V.19, №6. - P. 363-367. Вегетативные почки иссопа, отобранные от материнских растений, после стерилизации гипохлоритом кальция помещают на питательную среду, которая содержит макро- и микроэлементы на основе Мурасиге и Скуга (1962) - МС, дополнена 3% сахарозой, 0,7 % агаром (Difco Bacto-Agar, Germany), 1,0 мг/л тиамином, 0,5 мг/л пиридоксином, 0,5 мг/л никотиновой кислотой, и используют 100 мг/л раствора: 4,44 мкМ 6-бензиламинопурина (БАП), 1 мкМ 3-индолилмасляной кислоты (ИМК) и 0,57 мкМ гибереловой кислоты (ГК). Среднее количество микропобегов на эксплант достигает 6±1,5 (при концентрации БАП - 4,44 мкМ и ИМК - 0,49 мкМ).
Недостатком способа является низкий коэффициент размножения микропобегов, использование морфогенетических потенций только одного экспланта (вегетативная почка).
Известен способ регенерации микропобегов из листовых эксплантов Actinidia deliciosa в культуре in vitro, который использовали как прототип (Заявка № 2002120668 от 27.12.2002 г.). Метод включает в себя отбор листовых эксплантов от растений, полученных в культуре in vitro, и культивирование высечек листа на питательной среде, которая содержит половинную концентрацию макро- и микросолей, витамины МС, дополненной фитогормонами - БАП и индолилуксусной кислотой (ИУК). Через 4 недели культивирования на листовых эксплантах формируются адвентивные почки и микропобеги. Культивирование происходит при температуре 25°С, 16-часовом фотопериоде и интенсивном освещении 2-3 клк.
При использовании данного способа, с целью получения микропобегов из листовой ткани иссопа, культивируя их на питательной среде с БАП и ИУК, не удавалось добиться массового образования адвентивных почек из листовых эксплантов.
В основу изобретения поставлена задача: усовершенствовать способ регенерации растений из листовой ткани в условиях in vitro за счет подбора условий культивирования листовых дисков H.officinalis с целью максимального выхода генетически однородного растительного материала.
Поставленная задача решается тем, что в способе прямой регенерации микропобегов H.officinalis, которая состоит из отделения листовых эксплантов от растений, полученных в культуре in vitro, и культивирования эксплантов на питательной среде, которая содержит половинную концентрацию макро- и микросолей, витамины на основе МС и фитогормоны, в соответствии с изобретением на питательную среду в качестве фитогормона вводят вещество цитокининового типа действия, листовые экспланты иссопа отделяют от микропобегов после 4-5 пассажа в культуре in vitro и их культивирование проводят при низкой интенсивности освещения.
Существенные признаки заявленного способа имеют причинно-следственную связь с достигнутым результатом. В случае использования высечек листа с микропобегами иссопа, после первых трех субкультивирований на листовых эксплантах формировался каллус или единичные адвентивные почки, которые в дальнейшем не образовывали микропобеги. В случае использования высечек листа с микропобегами иссопа после 4-5 пассажей в культуре in vitro интенсивность образования адвентивных почек и регенерация микропобегов достигали 90%. В случае использования высечек листа с микропобегами иссопа после 6-8 пассажей наблюдали массовую регенерацию микропобегов, однако основная их часть была витрифицирована (обезвожена) и не способна для дальнейшего размножения.
Частота побегообразования увеличивалась при снижении интенсивности освещения до 1-1,5 клк и достигала 90%. Повышение интенсивности освещения до 2-3 клк (стандартные параметры для большинства растительных объектов) снижало частоту регенерации микропобегов до 50-60%.
В качестве вещества цитокининового типа действия, которое индуцирует образование и развитие меристем, а также регенерацию микропобегов в питательной среде, использовали тидиазурон (TDZ) - C9H8N4OS.
Предложенный способ выполняется таким образом: приготавливают питательную среду согласно существующей методике. Состав питательных сред представлен в таблице 1.
Состав питательной среды для размножения растений иссопа
Таблица 1
Компоненты | Питательные среды для разных этапов размножения | ||
1 | 2 | 3 | |
Культура вегетативных почек | Культура листовых дисков | Укоренение in vitro | |
Макроэлементы, мг/л: | |||
NH4NO3 | 825,0 | 825,0 | 412,5 |
KNO3 | 950,0 | 950,0 | 475,0 |
СаС12·2Н2О | 220,0 | 220,0 | 110,0 |
MgSO4 .7H2O | 185,0 | 185,0 | 92,5 |
КН2РО4 | 85,0 | 85,0 | 42,5 |
Na2EDTA | 37,3 | 37,3 | 37,3 |
FeSO4·7H2O | 27,8 | 27,8 | 27,8 |
Микроэлементы, мг/л: | |||
Н3ВО3 | 6,2 | 6,2 | 3,1 |
MgSO4·4H2O | 22,3 | 22,3 | 11,15 |
ZnSO4·7H2O | 8,6 | 8,6 | 4,3 |
KJ | 0,83 | 0,83 | 0,415 |
Na2M0O4·2H2O | 0,25 | 0,25 | 0,125 |
CuSO4·6H2O | 0,025 | 0,025 | 0,0125 |
Органические вещества: | |||
Глицин, мг/л | 2,0 | 2,0 | 2,0 |
Мезоинозит, мг/л | 50,0 | 50,0 | 25,0 |
Никотиновая кислота, мг/л | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
Пиридоксин - НСl, мг/л |
0,5 | 0,5 | 0,5 |
Тиамин - НСl, мг/л | 0,1 | 0,1 | 0,1 |
Зеатин, мкМ | 2,28 | - | - |
Тидиазурон, мкМ | - | 4,0-7,0 | - |
Кинетин, мкМ | 4,6 | - | - |
ИМК, мкМ | 0,49 | - | 8,0-11,0 |
Сахароза, мг/л | 30000,0 | 30000,0 | 15000,0 |
Агар, мг/л | 6000,0 | 6000,0 | 6000,0 |
рН | 5,6 | 5,6 | 5,6 |
Сегмент микропобега иссопа с латеральной почкой помещают на питательную среду для культивирования вегетативных почек. Интенсивность освещения составляет 2,5-3 клк, температура 25±1°С, фотопериод 16 часов. Через пять суток наблюдают образование микропобегов. Нормально сформированные микропобеги без морфологических изменений через 2 недели культивирования удлиняются до 3-4 см. Их микрочеренкуют на сегменты с латеральной почкой и снова помещают на исходную среду №1 (табл.1). Микрочеренкование производят через 2-3 недели культивирования. Вначале коэффициент размножения не превышает 1:2, но после 4-5 пассажа достигает 1:4. У листьев микропобегов после 4-5 субкультивирования вырезают диски, которые помещают на питательную среду №2 (табл.1), которая содержит половинную концентрацию макроэлементов, полный набор микроэлементов и витаминов по МС, дополненную цитокинином - тидиазуроном в концентрации 4,0-7,0 мкМ (табл.2). Из данных таблицы видно, что максимальное количество адвентивных почек и микропобегов образуется на листовых эксплантатах после 8 недель при оптимальной концентратции тидиазурона. Через 8 недель культивирования листовых эксплантов происходит активное формирование адвентивных почек (16-20 шт./эксплант), при концентрации тидиазурона 9,0 мкМ листовые экспланты формируют каллус.
Влияние количества пассажей микропобегов на регенеративную способность листовых дисков подтверждается данными таблицы 3. Из данных таблицы видно, что листовые экспланты, взятые с микропобегов иссопа после 3-х субкультивирований в условиях in vitro, образуют каллус; адвентивные почки и микропобеги отсутствуют. Максимальное количество адвентивных почек и побегов образуется на эксплантах, отобранных с листовых микропобегов иссопа, после 4-5 субкультивирований в условиях in vitro. После 6-8 пассажей на листовых эксплантах образуется масса обезвоженных и в дальнейшем нежизнеспособных микропобегов иссопа.
Таблица 2
Влияние концентрации тидиазурона на частоту регенерации микропобегов иссопа из листовых эксплантов условиях in vitro
Концентрация тидиазурона, мкМ | Количество листовых эксплантов с микропобегами, % (*) | |||
Форма 80882 | Форма 38285 | |||
4 недели | 8 недель | 4 недели | 8 недель | |
0,5 | 1,2±0,1 | 8,0±1,4 | 1,5±0,1 | 9,0±1,2 |
1,0 | 1,5±0,1 | 8,0±1,4 | 2,0±0,2 | 10,0±3,5 |
3,0 | 10,0±2,0 | 20,0±2,5 | 20,0±3,0 | 40,0±7,9 |
6,0 | 25,0±3,0 | 55,0±3,0 | 45,0±5,0 | 90,0±4,0 |
9,0 | 5,0±0,5 | 9,0±1,6 | 10,0±2,0 | 20,0±2,5 |
(*)форма 80882 - иссоп с синим окрашиванием венчика цветка; форма 38285 - иссоп с розовым окрашиванием венчика цветка.
Таблица 3
Влияние количества субкультивирований микропобегов на регенерационную
способность листовых эксплантов иссопа в условиях in vitro
№ пассажа | Регенерационная способность листовых дисков | |
Морфогенетические процессы | Коэффициент размножения | |
1-3 | Образование каллуса | 0 |
4-5 | Адвентивное побегообразование | 1:16-1:20 |
6-8 | Образование обезвоженных микропобегов | 1:10 |
Снижение интенсивности освещения до 1-1,5 клк стимулирует образование микропобегов иссопа в условиях in vitro. Это подтверждается данными таблицы 4.
Таблица 4
Влияние интенсивности освещения на частоту регенерации микропобегов иссопа у листовых эксплантов в условиях in vitro
Интенсивность освещения, клк | Количество листовых эксплантатов с микропатогенами, % (*) | |
Форма 80882 | Форма 38285 | |
0 | 0,0 | 0,0 |
1 | 80,0±5,0 | 35,0±11,0 |
1,5 | 90,0±4,0 | 50,0±4,3 |
2 | 75,0±5,0 | 40,0±7,9 |
2,5 | 55,0±3,0 | 27,0±3,0 |
3 | 35,0±5,0 | 16,0±6,1 |
(*)форма 80882 - иссоп с синим окрашиванием венчика цветка; форма 38285 - иссоп с розовым окрашиванием венчика цветка.
Из данных таблицы видно, что при отсутствии освещения не происходит образование адвентивных почек и побегов. Оптимальный уровень интенсивности освещения для инициации побегообразования и пролиферации микропобегов иссопа составил 1,5 клк. Частота регенерации и количество микропобегов на листовой диск значительно уменьшились при интенсивности освещения 2 клк, а при интенсивности освещения 3 клк только низкий процент листовых дисков был способен к регенерации и чаще всего экспланты погибали.
Следует отметить, что адаксиальное размещение листовых дисков иссопа на питательной среде повышает частоту регенерации микропобегов иссопа до 90%. В течение года из листовых дисков от одного растения иссопа можно получить около 10000 микропобегов, которые отделяют и в дальнейшем укореняют.
Укоренение микропобегов проводят на питательной среде №3 (табл.1), которая содержит 8,0-11,0 мкМ ИМК. Культуральные сосуды выставляют на стеллажи. Интенсивность освещения составляет около 2 клк, температура 21±1°С, фотопериод 14 часов. Через 2-2,5 недели наблюдается образование максимального количества корешков длиной 5-6 см. Число укорененных побегов иссопа в условиях in vitro составляет 63-72 % (в зависимости от формы иссопа). Полученные растения готовы к высадке в субстрат и адаптации in vivo.
Способ регенерации адвентивных микропобегов Hyssopus officinalis L. в условиях in vitro включает в себя отделение листовых дисков от растения, полученных в культуре in vitro, культивирование их на модифицированной среде Мурасиге и Скуга, дополненной фитогормонами, который отличается тем, что листовые диски отделяют после 4-5 пассажей микропобегов в культуре in vitro, далее культивируют их на модифицированной среде МС с половинной концентрацией микроэлементов и дополнительными веществами цитокининового типа действия, а именно тидиазуроном в концентрации 4,0-7,0 мкМ, причем культивирование проводят при низкой интенсивности освещения, которая составляет 1,0-1,5 клк.